条斑紫菜(Pyropia yezoensis)作为一种重要的经济海藻，在中国，其主要分布在长江以北的温带海域，是中国北方重要的养殖藻类，具有显著的经济价值^[1]。在条斑紫菜的产业养殖过程中，温度是重要的生态因子，适宜的环境温度是高产所必需的先决条件之一^[2]。近年来，随着温室效应加剧，全球气候变暖导致海水温度持续升高，条斑紫菜在高温环境下的生存能力和产量受到了严峻的挑战，给紫菜养殖产业造成了严重的影响^[3]，因此生产上迫切需要具有耐高温特性的条斑紫菜良种。

目前，关于紫菜高温耐受性的研究大多集中在叶状体阶段，而丝状体阶段的相关研究较少。丝状体标志着紫菜处在从孢子发育到成熟的关键转折期，是育苗的主要形式^[4]。丝状体的生长发育阶段主要包括：营养藻丝、孢子囊枝和壳孢子形成与放散三个阶段。不同阶段受环境因子的影响不同。在藻丝阶段，高温胁迫会对紫菜的生长发育、光合作用以及生理代谢产生显著影响^[5]。因此，建立科学合理的丝状体耐高温性状评价体系，对评估其耐高温能力、推进紫菜高温适应性改良及耐高温品种的选育至关重要^[6]。

在本研究团队的实验室，将20 ℃设定为贝壳丝状体的正常生长温度，24 ℃作为孢子囊枝形成的适宜温度。考虑到温度升高会导致营养丝状体提前进入膨大阶段，为在施加高温胁迫的同时尽量避免该过程的发生，本研究主要以本实验室保存的95个条斑紫菜品系贝壳丝状体为研究对象，聚焦于其营养丝状体阶段，分别在20 ℃(适温条件)和25 ℃(高温条件)下培养，并测定其多个生长指标，以评估其耐高温特性。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验材料为藻类遗传育种实验室种质库保存的个条斑紫菜丝状体藻种。这些品系来源于山东省青岛市、威海市、日照市和辽宁省大连市海区随机采集的野外品系，以及大连养殖场和日照养殖场的养殖品系。

1.2 指标测定 1.2.1 样品处理

在超净台中取出在藻种库中保存的丝状体，通过显微镜观察藻丝的健康状况，筛选出无杂藻污染且状态良好的品系。将上述品系的丝状体分别放入含有无菌海水且添加培养基的250 mL培养瓶内静置培养，设置培养条件如下：温度(20±1)℃，光照强度(50±3) μmol·m^-2·s^-1，光周期L∶D=12 h∶12 h。每升海水中添加20 mL PES培养基，每3 d更换一次海水并补充培养基。换水3次后，再次在显微镜下观察各品系丝状体的活化状态。

1.2.2 生长率测定

将活化好的丝状体在超净台中取出，使用经高温水煮灭菌的破壁机(仅搅拌杯和搅拌刀座进行高温灭菌)打碎约30 s，使藻丝长度控制在200~300 μm。随后将藻丝接种于灭菌后的镜贝贝壳上，每个贝壳的接种密度为50根藻丝，每个品系接种在6枚贝壳(直径3 cm)上，培养于含有PES培养基的灭菌海水中，于6孔板中培养。在20 ℃暗处理3 d后，分别放在20和25 ℃下培养，光照强度24 μmol ·m^-2·s^-1，光周期12L∶12D。培养10 d后，利用配置RGB摄像头的倒置显微镜拍摄贝壳中条斑紫菜丝状体的图像，通过Image J软件计算生长在贝壳上的单根藻丝的主枝长度(Main branch length，MBL)、侧枝长度(Side branch length，SBL)、侧枝数量(Number of main branch，NLB)主枝数量(Number of side branch，NMB)和丝状体面积(Conchocelis area，CA)等性状，每个品系设置3个重复，每个重复各统计10根藻丝的上述各指标。培养15 d后，同样利用倒置显微镜拍照记录贝壳中丝状体的图像，通过Image J软件计算贝壳上单个藻丝的面积(CA)，同样设置3个重复，每个重复统计10个藻落的面积。

1.3 数据统计分析

利用Microsoft Excel 2010软件对95个品系的5个指标数据进行整理、统计分析，计算耐热系数和隶属函数值，利用SPSS Statistics 25.0软件对数据进行相关性分析、隶属函数分析、熵值法分析和多元线性回归分析，采用Microsoft Excel 2010、Origin 2024软件对数据进行可视化作图。

1.3.1 耐热系数^[7]

耐热系数(Heat tolerance coefficient，HTC)用于衡量材料在高温条件下的稳定性。一般来说，HTC值越高，意味着材料在高温环境下的稳定性越强。为消除不同品系遗传因素对各性状的影响，将高温下测得的各性状值与适温下测得的各性状值的比值作为各性状的HTC(R_HTC)：

$ R_{\mathrm{\tiny~HTC~}}=\frac{X_{\mathrm{\tiny~L~}}}{X_{\mathrm{\tiny~N~}}}。$

(1)

式中：X_L是在高温下测得的各性状值；X_N是在适温下测得的各性状值。

1.3.2 隶属函数值^[8]

隶属函数值(Membership function value，MFV)用于描述某个元素属于某个模糊集合的程度。具体来说，隶属函数值是一个从集合中的元素到[0, 1]区间的映射，它的值表示该元素属于某个模糊集合的程度。值为1，表示该元素完全属于该模糊集合；值为0，表示该元素完全不属于该模糊集合；值介于0~1，表示该元素在一定程度上属于该模糊集合。隶属程度越接近1，表示其隶属度越强，越接近0，表示其隶属度越弱。

为消除不同指标量纲的差异，对各性状的HTC求其隶属函数值，其中，当所用性状为正向和逆向指标时，分别采用如下表达式：

$ X_{m n}^*=\frac{X_{m n}-X_{\min }}{X_{\max }-X_{\min }}, $

(2)

$ X_{m n}^*=1-\frac{X_{m n}-X_{\min }}{X_{\max }-X_{\min }} 。$

(3)

式中：X_mn、X_mn^*分别为标准化前、后第m个样本第n个指标(HTC)的隶属函数值；X_max为某性状的HTC在所有样本中的最大值；X_min为某性状的HTC在所有样本中的最小值。

1.3.3 熵值法

熵值法(Entropy method，EM)是一种基于信息论的数学方法，主要用于多指标决策分析中，通过计算指标的信息熵来确定各指标的重要性或权重。信息熵反映了一个系统的无序度或不确定性。信息熵越大，表示该指标的信息越分散、不确定性越高，因此其权重越小；反之，信息熵越小，表示该指标的值越集中且不确定性越低，其权重则越大。

计算第m个指标下第n个对象的比重P_mn：

$ P_{m n}=\frac{X_{m n}^*}{\sum\limits_{n=1}^m X_{m n}^*} 。$

(4)

计算第m个指标的熵值e_m：

$ e_m=-\sum\limits_{n=1}^m P_{m n} \ln \left(P_{m n}\right) 。$

(5)

计算第m个指标的权重w_m

$ w_m=\frac{1-e_m}{\sum\limits_{m=1}^m\left(1-e_m\right)}。$

(6)

1.3.4 综合评价指标

根据指标权重计算各品系的耐热性综合评价指标：

$ D_m=\sum\limits_{m=1}^n\left(X_{m n}^* \times w_m\right) 。$

(7)

式中D_m为第m个品系的耐热性综合评价指标值，该值越大，说明品系对高温的综合耐受性越强。

1.3.5 多元回归分析

以单项HTC为自变量，以耐高温综合评价指标为因变量，通过SPSS软件进行多元线性回归分析得到耐热性的拟合方程。

2 结果与分析 2.1 高温和适温下各品系表型性状数值的分布及相关性分析

在适温(20 ℃)下，通过对95个品系的5个性状进行统计分析及相关性分析发现，主枝数量的直方图接近钟形，符合正态分布，其余性状偏左或偏右，符合偏正态分布(见图 1(A))。在高温(25 ℃)下，通过对95个品系的5个性状进行统计分析以及相关性分析发现，主枝数量直方图接近钟形，符合正态分布，其余性状符合偏正态分布(见图 1(B))。

2.2 不同品系高温和适温下表型性状的描述性统计分析

在20 ℃条件下，对95个品系的5个性状的最值、均值、标准差、偏度、峰度以及变异系数进行统计分析，结果如表 1所示，主枝长度(MBL)、侧枝长度(SBL)、侧枝数量(NLB)和丝状体面积(CA)等性状表现出右偏分布，这意味着这些性状的数值集中在较小的范围内，但也有少量较大的值，导致数据分布较为分散且不对称。主枝数量(NMB)表现出轻微左偏分布，这说明大多数数据集中在较大值范围，而较小值较为罕见。即数据的整体分布相对集中且偏向较大值。

从变异系数来看，NMB的变异系数为18.1%，介于10%~20%之间，这表明这两个性状的数据波动性适中。虽然数据点相对于均值有一定的分散，但分散程度并不剧烈，波动幅度适中。而其余性状的变异系数均大于20%，这表明这些性状的数据离散性较强，数据点之间差异较大，波动性较高。

在25 ℃下，各品系5个性状的最值、均值、标准差、偏度、峰度以及变异系数统计分析结果如表 2所示，与表 1对比分析可知，MBL、CA和SBL在25 ℃下的数据显示出右偏增大，且峰度有所增加，这意味着这些性状的数据分布变得更加集中，且整体数据趋向于更小的范围。即25 ℃时SBL的分布相较于20 ℃时更加集中，且数据波动性降低。

此外，部分性状(如MBL、SBL和NLB)的变异系数在25 ℃时有所减小，这表明在较高的温度下，数据的波动性普遍降低，这意味着数据点之间的差异性减少，性状的变化趋向于一致。

2.3 各性状HTC及其隶属函数值

从各性状HTC的变异系数来看，各性状的HTC表现出不同的稳定性。所有性状的变异系数均大于20%，这表明这些数据的离散程度较高，数据分布范围广。其中NLB的变异系数达31.3%，这表明该性状的数据离散性较强，数据点之间的差异大。

根据式(2)和(3)计算各性状HTC的隶属函数值，以消除不同指标量纲的差异。各性状HTC的隶属函数值如表 3和图 2所示。NLB的“须”较长，这表明这该性状的数据变异性较大。即在高温胁迫下，该性状表现出的变化范围较大，可能不够稳定，因此被认为是高温胁迫下的主要影响因子。MBL和CA这两个性状的数据分布较集中，表明该性状在高温胁迫下具有较高的稳定性，能够较好地适应高温环境。

2.4 耐热性的熵值法分析

通过熵值法计算各指标的权重，结果由表 4可知，MBL、NLB以及SBL的权重相对较高(均大于20%)，说明上述性状在高温耐性中起到较为重要的作用。NMB和CA的权重相对较低，表明它们在高温耐性中的重要性稍弱于其他性状。

2.5 综合评价指数及耐热级别划分

依据熵值法计算各指标权重值，将各品系各项指标值与其权重值相乘并累加，获得各品系的综合评价指数(D)。通过D来评价各品系的耐热性，D越大耐热性越强。根据D对各品系进行系统聚类分析，对其耐热性进行等级划分，将95份测量品系的耐热性分为5个级别(见图 3)。

2.6 综合评价指标值与耐热系数的相关性

将综合评价指数(D)与各性状的HTC进行相关性分析，结果显示(见图 4)，D与各性状间的HTC之间存在一定的相关性，且均正相关。相关系数反映各性状HTC对D的影响程度，由图 4可知，侧枝数量对D的影响最突出，丝状体面积性状对D的影响最小。

2.7 条斑紫菜耐高温评价模型

对耐热性进行多元回归分析，结果如表 5所示，共拟合了5个方程模型，纳入模型的变量共5个。当只有侧枝数量一个变量时，回归方程判定系数R²为0.565 2，F检验达到极显著水平，说明回归方程具有一定的解释能力。随着选入方程的变量依次增加，判定系数也逐渐增大，为使鉴定方法简化，选用D_i=0.173×K_{NLB, i}+0.146×K_{SBL, i}+0.112×S_{CA, i}+0.181×K_{NMB, i}+0.115×K_{MBL, i}(式中各变量符号含义如表 5表注所示)作为耐热评价模型，其判定系数为0.970，F检验均达到极显著水平，因此该模型能很好地评价条斑紫菜耐热性。

3 讨论 3.1 条斑紫菜贝壳丝状体高温下的表型性状

将25 ℃下各性状数据与20 ℃下对比可知，25 ℃时，贝壳丝状体中营养藻丝的各生长指标均呈下降趋势。陈昌生等^[9]通过在不同温度(7~31 ℃)下培养坛紫菜的自由丝状体发现，在19~23 ℃时，坛紫菜的自由丝状体生长状况良好，当超过上述温度后，自由丝状体的生长速度减缓，当温度升高至30 ℃时，丝状体出现发白死亡的情况。上述实验结果与本研究的实验结果相符。本研究中，在高温(25 ℃)条件下，侧枝数量(NLB)表现出最显著的下降趋势(＞20%)，且个体间差异增大，提示该性状对高温胁迫最敏感，主枝相关性状(NMB和MBL)下降约11%，这说明主枝生长普遍受抑制。形态性状(SBL和CA)受影响相对较小(< 11%)，可能因其受多基因调控而起到缓冲作用。

3.2 条斑紫菜丝状体耐高温评价指标

目前条斑紫菜耐高温性评价主要通过多个性状单独分析的方法评估紫菜的耐高温性^[10]，然而植物的耐高温性是一个复杂的过程，将多个指标进行单独评价往往无法全面反映紫菜的整体耐热能力。当前，研究者在研究紫菜的耐高温性时，主要集中在叶状体阶段，而丝状体阶段的相关研究较少^[11]。叶状体阶段主要通过在不同温度下测量叶状体的长、宽、面积及厚度来评估耐热性^[12]。而丝状体阶段则主要通过壳孢子来评估耐热性。如付春辉等^[13]通过比较T-17品系和WT品系在18、23、24以及25 ℃下壳孢子的放散量以及壳孢子的萌发量和畸形率等方面评估紫菜的耐高温性。吴航航等^[14]通过壳孢子在高温下的存活率、叶状体的生长速率、叶状体的厚度，以及壳孢子放散量等方面评价紫菜的耐高温性。

而本研究所选取的指标主要为丝状体阶段的生长指标，并将上述多个指标结合起来，初步构建了条斑紫菜丝状体中营养藻丝阶段的耐高温评价体系。相比将多个指标进行单独评价，本研究所选取的综合评价方法能够综合考虑生长速率，提供了更为准确的耐高温性评估。通过结合这些指标，可以更好地理解温度对条斑紫菜丝状体的综合影响，进而揭示其在高温胁迫下的适应机制。其中侧枝数量(NLB)和侧枝长度(SBL)对耐高温能力的贡献最大，推测条斑紫菜丝状体耐高温能力的显著提升主要源于其协同的“结构-功能”适应机制。高温环境下，快速生长的品系可能面临更大的代谢压力，侧枝性状(NLB/SBL)可能代表一种“减速但稳定”的生长策略。NLB增加可使生物量分配更分散，降低单一位点的代谢负荷。相比之下，主枝长度(MBL)主要参与营养生长竞争，在耐热适应性中贡献较弱，但目前构建模型所涉及的指标仍不够全面，除了生长指标外，植物的耐高温性还与多种生理过程密切相关，如光合作用、抗氧化酶活性、膜结构稳定性、渗透调节物质的合成和热激蛋白的表达等^[15-16]。因此，未来的研究还应进一步拓展评价指标。

3.3 条斑紫菜丝状体耐高温评价方法

评价方法的选取上，每种方法各有优缺点。综合指数法、层次分析法以及模糊综合评价法等方法虽然常用，但主要缺点是主观性较强^[17]，可能受到评估者的个人偏好或判断的影响。而贝叶斯网络法则需要大量的专家知识，并且涉及网络结构设计和条件概率估计，这使得模型构建过程相对复杂。此外，本研究在分析过程中，比较了主成分分析法和熵值法，熵值法是一种基于信息熵的统计方法^[18]，常用于确定不同评价指标的权重。在植物高温耐受性的评价中，熵值法可以帮助确定各生理、分子和生长指标的重要性，从而根据不同指标的权重综合评价耐热性。主成分分析法是一种数据降维的统计方法，常用于将多维的评价指标数据转化为少数几个主成分，以便更简洁地分析和评估植物的高温耐受性。通过主成分分析，可以消除各指标之间的多重共线性，识别出对植物耐热性影响最显著的几个变量，但主成分分析法需满足Kaiser-Meyer-Olkin(KMO)值大于0.5的前提条件^[19]。然而，本实验数据的KMO值小于0.5，表明数据不适合进行因子分析或主成分分析，可能无法提取出有效的因子或主成分。因此，本研究最终选择了熵值法，并与聚类分析法、回归分析法及隶属函数值法等方法相结合，进一步分析了各品系的耐热性，构建了丝状体的耐高温评价模型，方便了后续单个或者几个品系的耐高温评价，这将有利于后续研究、筛选耐高温品系等工作。

4 结语

在20和25 ℃下分别测定条斑紫菜贝壳丝状体生长相关的5个性状指标。利用熵值法，得到每个指标在评价体系中的权重。其中MBL、NLB以及SBL对耐高温综合指标的贡献度较大。基于耐热系数、隶属函数值获得每个品系的综合评价指数(D)。通过系统聚类分析法，将所有品系划分为5个不同的耐热等级。并运用多元线性回归分析构建并筛选出D_i=0.173×K_{NLB, i}+0.146×K_{SBL, i}+0.112×S_{CA, i}+0.181×K_{NMB, i}+0.115×K_{MBL, i}作为丝状体耐热评价模型，该模型可用于耐高温品系的筛选和培育。