2026, Vol. 56
2. 国家海洋环境监测中心，辽宁 大连 116085;
3. 青岛市环境保护科学研究院, 山东 青岛 266003;
4. 崂山实验室, 山东 青岛 266071
生物多样性不仅是人类赖以生存的物质基础，还与社会经济发展密切相关。随着人类活动、气候变化对生态环境造成的影响日益加剧，生物多样性快速降低及其引发的生态安全问题已逐步威胁社会发展[1]。水库作为城市最重要的水源地，对城市地区的社会经济发展具有重要的支撑作用。水生生物群落结构组成受水质和营养状态的影响，能够反映水库水生态环境的健康状况[2-5]。浮游生物是水生态系统能量流动和物质循环的最主要环节，具有对水环境变化敏感的生物学特性，其群落特征及种群动态均与水环境理化因子存在着密切的关系，能够成为水生生态环境变化的敏感指示器，可有效指示河流水域的水质现状，揭示水域健康状况[6-7]。因此，研究浮游生物群落结构及分布特征、评估生物多样性，对于探究水体生态系统健康状况、制定相应的保护措施具有重要意义。
目前，传统的形态学生物多样性调查方法(即传统形态学检测方法)存在较大局限性。例如，传统形态学检测方法会对栖息地环境造成不同程度的破坏，捕捞随机性强，很有可能漏过关键物种，且若要提高多样性调查结果的全面性，只能增加捕捞次数、扩大捕捞范围，但这又对保护区的生境造成破坏。环境DNA (Environmental DNA，eDNA)是从环境中(例如沉积物、水体)直接提取到的DNA片段，主要包含不同生物体释放到环境中的胞内DNA以及细胞裂解或死亡后的胞外DNA[8-10]。相较于传统形态学检测方法，eDNA技术以其更高的精度、更低的成本以及对环境更友好等特点而受到广泛关注[11]。目前在国内的生物多样性检测中，eDNA技术已经在鱼类多样性和特定种检测过程中得到广泛应用[12-13]，而在低营养级的浮游生物检测中，仍采用拖网采集方法，这对环境造成一定程度的影响。
崂山区域位于青岛市东部、黄海之滨，拥有丰富的淡水资源。受全球变化和人类活动影响，近年来，夏季崂山区域内的重要水源地的水位、容量变化均较大，对该区域内的水质状况及水生态系统健康均产生不同程度的影响。因此，了解崂山区域重要水源地的浮游生物群落结构组成特征、评估其生物多样性，对水库水质保护和崂山区域供水安全保障具有重要意义。而目前在本区域浮游生物的多样性调查工作中仍沿用传统形态学检测的方法，这可能对该区域内的生态环境带来潜在的影响。本研究基于夏季对崂山区域内典型水库、河流中的生态调查，首次采用以传统形态学检测为主、以eDNA技术为补充的调查方法，以期更全面、准确地评价该区域内的浮游生物群落结构及多样性。同时，通过比较两种调查方法结果，评估eDNA技术在崂山区域作为低营养级浮游生物常规检测方法的适用性，为青岛崂山区域水生生物多样性检测及保护提供新的技术支持。
1 材料与方法 1.1 调查区域概况崂山省级自然保护区位于山东省青岛市崂山区境内，地处山东半岛东南沿海(36°05′N—36°19′N，120°24′E—120°42′E)，濒临黄海，属暖温带森林生态系统，其主要保护对象为森林生态系统、野生动植物及濒危物种资源，总面积446 km2。保护区内共有水库31座，主要河流21条，其中崂山水库和白沙河为代表水体。
1.2 采样点的设置与采样时间2022年6—8月，对崂山保护区域内崂山水库、大石村水库、书院水库及白沙河的水生态状况进行了全面调查。此次调查的类群主要包括浮游植物和浮游动物。根据河流和水库的水生态状况，在上述3座水库和1条河流中共布设15个点位，如图 1所示。
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图 1 崂山保护区域浮游生物调查点位分布示意图 Fig. 1 Distribution of planktonic survey sites in the Laoshan protected area |
参照《全国淡水生物物种资源调查技术与规定》的要求，在分别于崂山水库的进水口区域(1个点位)、库区中心区域(3个点位)、出水口区域(1个点位)和出水口筑坝区域(1个点位)设置采样点位(共6个点位)。对于大石村水库和书院水库，分别在二者的进水口、中心、出水口各设置1个采样点位，2座水库共设置6个采样点位。在白沙河上、中、下游分别设置1个采样点位，共设置3个采样点位。
1.3 样品采集及处理 1.3.1 浮游植物定量采集时，用采水器取各水层等量水样，混匀后取水样1 L。用25号浮游生物网在表层水缓慢拖拽采集定性样品。所采集样品用鲁哥试剂固定保存。定量样品计数和生物量计算方法参照文献[14-15]进行。利用光学显微镜进行物种鉴定和计数，物种鉴定参照文献[16]。
1.3.2 浮游动物浮游动物定性样品采集方法与本文1.3.1节中浮游植物的定性样品采集方法相同。原生动物和轮虫定量样品的采集步骤如下：取1 L水样，用鲁哥试剂固定，然后沉降、浓缩至30 mL。枝角类和桡足类定量样品的采集步骤如下：取20 L水样，然后用25号浮游生物网进行过滤。定量样品计数和生物量计算方法参照《水生态检测技术要求-淡水浮游动物(试行)》[17]进行。利用光学显微镜进行物种鉴定和计数，鉴定方法参照文献[18-19]。
1.4 eDNA测定eDNA样品的DNA提取、扩增以及生物信息学分析均委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。
(1) 样品采集：采集10 L水样，用直径50 mm、孔径0.45 μm的混合纤维素酯滤膜搭配真空泵进行抽滤，将滤膜置于-20 ℃冷冻保存，以备后续DNA提取。
(2) DNA提取：采用DNeasy血液和组织试剂盒(品牌：QIAGEN)对滤膜收集的eDNA进行提取。提取完成后，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，并使用NanoDrop2000测定DNA的浓度及纯度，以进行后续试验。
(3) DNA扩增、建库及测序：使用特定引物分别对收集到的eDNA进行PCR扩增。扩增程序设定如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s (27个循环)；72 ℃稳定延伸10 min。对PCR产物进行纯化后，进行浓度和质量检测，为测序文库构建做准备。最终依据Illumina测序平台的建库要求，通过”Y”字形接头连接、去除接头自片段、PCR扩增进行文库模版富集、氢氧化钠变性的步骤，产生单链DNA片段，完成测序文库构建，并采用Illumina测序平台对扩增子进行高通量测序。
(4) 生物信息学分析：使用Usearch软件对测序数据质量进行质控和过滤，在聚类过程中去除嵌合体，将序列以97%的相似性聚类到可操作的分类单元(Operational taxonomic units，OTUs)，为得到每个OTU对应的物种分类信息，采用Blast比对的方法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在Greengenes、SILVA、FDA和NCBI数据库中进行比较注释。本文将分属于同一类群的OTU进行组合，以估计该类群的丰度。基于OTU聚类分析结果，对OTU进行多种多样性指数分析，并对测序深度进行检测。可视化分析使用R语言的ggplot2扩展包和Origin 2020b软件。
1.5 数据分析与处理生物多样性指数和优势度等指标采用下列公式计算。
(1) Shannon-Wiener多样性指数(H′):
| $ H^{\prime}=-\sum\limits_{i=1}^S P_i \log _2 P_i\;。$ | (1) |
(2) Pielou均匀度指数(J):
| $ J=H^{\prime} / \log _2 S\;。$ | (2) |
(3) Mchaughton优势度指数Y:
| $ Y=\frac{n_i}{N} \times f_i\;。$ | (3) |
(4) 生物多样性阈值(TB):
| $ T_{\mathrm{B}}=3 H^{\prime} \times J\;。$ | (4) |
式中: Pi为某物种i的个体在群落中的比例，Pi=ni/P，其中P为群落中所有物种的总密度；S为样方内的种数；H′为群落中生物种类，H′愈大意味着群落的复杂程度越高；ni为某物种i的密度；N为所有物种的个体总数；fi为某物种i出现的频率，即占位数(某物种i在所有取样点中实际被记录到的次数)与总占数(所有取样点的总数)之比(%)。
根据生物多样性阈值分级评价标准[20]来判断调查水域生物群落结构状况：TB < 0.6为差；0.6≤TB≤1.5为一般；1.6≤TB≤2.5为较好；2.6≤TB≤3.5为丰富；TB>3.5为非常丰富。
使用Excel2024和SPSS22.0软件进行数据处理和统计学分析；使用Origin pro8.0和ArcGIS10.6软件绘制统计图。
2 结果分析 2.1 浮游植物群落结构特征采用形态学方法，共鉴定出浮游植物109种，隶属于7门、10纲、35科、61属。其中：从白沙河流域鉴定出的种类(45种)最多，隶属于7纲、10科、15属，具体包括蓝藻纲3种、隐藻纲3种、绿藻纲7种、双星藻纲2种、甲藻纲1种、羽纹纲26种、硅藻门的中心纲3种；从大石村水库鉴定出的种类(22种)最少，隶属于8纲、13科、16属，具体包括绿藻纲8种、双星藻纲1种、甲藻纲1种、羽纹纲5种、中心纲2种、黄群藻纲1种、蓝藻纲1种、隐藻纲3种(见图 2)。浮游植物的平均细胞密度为3.6×106 cells/L，平均生物量为1.73 mg/L(见图 3)。浮游植物以湖泊假鱼腥藻(Pseudanabaena limnetica)、链形小环藻(Cyclotella catenata)、并联藻(Quadrigula chodatii)等为优势种(见表 1)。经计算，Shannon-Wiener多样性指数平均值为2.38，Pielou均匀度指数平均值为0.68，生物多样性阈值平均值为1.64 (见表 2)。
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图 2 浮游植物的种类组成 Fig. 2 Species composition of phytoplankton |
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图 3 浮游植物的丰度(a)和生物量(b)组成 Fig. 3 Abundance (a) and biomass (b) composition of phytoplankton |
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表 1 崂山区地表水浮游植物优势种 Table 1 Dominant species of phytoplankton in surface water from Laoshan area |
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表 2 崂山区地表水生物多样性指数 Table 2 Biodiversity index of surface water in Laoshan Area |
采用传统采样方法共鉴定出浮游动物54种，隶属于5纲、22科、31属。其中：从崂山水库鉴定出的种类(29种)最多，隶属于5纲、18科、22属，具体包括甲壳纲10种、轮虫纲12种、纤毛纲2种、肉足纲3种、桡足纲2种；从白沙河流域鉴定出的种类(19种)最少，隶属于4纲、11科、13属，具体包括甲壳纲3种、轮虫纲9种、肉足纲4种、纤毛纲1种(见图 4)。浮游动物的平均密度为397.96 ind./L，平均生物量为5.31 mg/L(见图 5)。浮游动物以简弧象鼻溞(Bosmina coregoni)、累枝虫属(Epistylis)、圆筒异尾轮虫(Trichocerca cylindrica)、湖沼砂壳虫(Difflugia limnetica)和球砂壳虫(Difflugia globulosa)等为优势种(见表 3)。经计算，Shannon-Wiener多样性指数平均值为1.87，Pielou均匀度指数平均值为0.60，生物多样性阈值平均值为1.25 (见表 2)。
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图 4 浮游动物的种类组成 Fig. 4 Species composition of zooplankton |
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图 5 浮游动物的的丰度(a) 和生物量(b) 组成 Fig. 5 Abundance (a) and biomass (b) composition of zooplankton |
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表 3 崂山区地表水浮游动物优势种 Table 3 Dominant species of zooplankton in surface water from Laoshan Area |
采样点样品序列经控制过滤优化后，共获得978 942个有效序列，序列聚类后共获得4 227个OTUs(Operational taxonomic units)。结果显示，15个采样点位共鉴定出49个分类群，测试结果及物种注释结果如表 4所示。与传统形态学检测的结果相比，采用eDNA技术鉴定出的种类较少，共鉴定出浮游植物69种，隶属于2门、7纲、14目、25科、38属(见图 6)，以微拟球藻属(Nannochlorophsis)、金藻属(Chrysochromulina)、隐藻属(Cryptomonas)为优势属(见图 6)。其中，尖尾蓝隐藻(Chroomonas acuta)和卵形隐藻(Cryptomonas ovata)为两种方法共同鉴定出的优势种。比对不同样本的群落结构发现，不同采样点的浮游生物组成结构具有一定的差异。从白沙河(Baisha River)中共鉴定出53种，隶属于2门、7纲、12目、19科、24属，具体包括绿藻纲1种、绿尘藻纲1种、共球藻纲9种、圆筛藻纲9种、无壳缝纲1种、间藻纲1种、硅藻纲14种，其中衣藻属的未定衣藻(Chlamydomonas incerta)丰度最大；从大石村水库(Dashicun Reservoir)中共鉴定出47种，隶属于2门、6纲、11目、14科、19属，具体包括绿藻纲5种、绿尘藻纲4种、共球藻纲4种、圆筛藻纲6种、无壳缝纲3种、硅藻纲6种，其中小球藻属的Chlorella sp. MBTD-CMFRI-S026丰度最大；从崂山水库(Laoshan Reservoir) 中鉴定出46种，隶属于2门、7纲、13目、19科、27属，具体包括共球藻纲7种、绿尘藻纲3种、绿藻纲8种、间藻纲1种、无壳缝纲3种、圆筛藻纲11种、硅藻纲11种，其中直链藻属的Melosira ambiqua丰度最大；从书院水库(Shuyuan Reservoir)中共鉴定出25种，隶属于2门、7纲、11目、15科、19属，具体包括共球藻纲6种、绿尘藻纲3种、绿藻纲4种、间藻纲1种、无壳缝纲1种、圆筛藻纲4种、硅藻纲6种，其中骨条藻属的Skeletonema ardens丰度最大。
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表 4 崂山区域地表水eDNA宏条形码测试结果 Table 4 Results of environmental DNA metabarcoding in surface water from Laoshan Area |
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(①多肢轮虫属Polyarthra；②异尾轮虫属Trichocerca；③秀体属Diaphanosoma；④温剑水蚤属Thermocycops; ⑤Proteuxoa; ⑥喙蝽属Rhynocoris；⑦未分类Unclassified；⑧拟无柄轮虫属Anuraeopsis；⑨微拟球藻属Nannochloropsis；⑩金胞藻属Chrysochromulina；⑪腔轮虫属Lecane; ⑫隐藻属Cryptomonas；⑬Zabrachia；⑭微茧峰属Microplitis；⑮银币水母属Agaima；⑯象鼻溞属Bosmina；⑰中剑水蚤属Mesocyclops；⑱疣毛轮虫属Synchaeta；⑲沟蜷属Sulcospira；⑳鬃毛虫属Chaetonotus；㉑小球藻属Chlorella；㉒沼摇蚊属Limnophyes；㉓真跖轮虫属Euchlanis；㉔臂尾轮虫属Brachionus；㉕囊形轮虫属Ascomorpha；㉖丝囊霉属Aphanomyces；㉗龟甲轮虫属Keratella；㉘吉利亚藻属Guillardia；㉙Hellyethira；㉚疫霉属Phytophthora. ) 图 6 崂山区地表水浮游生物优势属 Fig. 6 Dominant plankton genus in surface water from Laoshan area |
本研究共鉴定出浮游动物84种，隶属2门、2纲、3目、15科、24属(见图 7)，明显多于传统形态学检测鉴定出的种类，以多肢轮属(Polyarthra)、异尾轮虫属(Trichocerca)和秀体溞属(Diaphanosoma)为优势属(见图 6)。其中暗小异尾轮虫(Trichocerca pusilla)和圆筒异尾轮虫(Trichocerca cylindrica)为两种方法共同鉴定出的优势种。从白沙河中鉴定出28种，隶属于2纲、2目、11科、14属，具体包括鳃足纲6种、单巢纲22种，其中腔轮属的新月腔轮虫丰度最大；从大石村水库中鉴定出46种，隶属于2纲、3目、13科、19属，具体包括鳃足纲8种、单巢纲38种，其中多肢轮属的未定种多肢轮虫(Polyarthra sp. WM-2017e)丰度最大；从崂山水库中鉴定出56种，隶属于2纲、3目、13科、19属，具体包括鳃足纲6种、单巢纲50种，其中多肢轮属的未定种多肢轮虫(Polyarthra sp. WM-2017e)丰度最大。从书院水库中鉴定出44种，隶属于2纲、3目、13科、20属，具体包括鳃足纲10种、单巢纲34种，其中秀体溞属中的一种模糊秀体溞(Diaphanosoma cf. dubium WM-2017a)相对丰度最大。
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图 7 崂山区地表水浮游生物种类组成 Fig. 7 Composition of plankton classified in genus level in surface water from Laoshan Area |
通过对样本中不同丰度的物种进行分块聚集形成群落丰度热图，结果表明，在调查区域中，轮虫(Rotifera)、节肢动物(Arthropoda)、定鞭藻门(Haptista)和绿藻门(Chlorophyta) 丰度较高；在属水平上，多肢轮属(Polyathra)、异尾轮属(Trichocerca)、秀体溞属(Diaphanosoma)、温剑水蚤属(Thermocyclops)、微拟球藻属(Nannochlorophsis)和金色藻属(Chrysochromulina)丰度较高(见图 8)。
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图 8 崂山区地表水浮游生物群落丰度热图 Fig. 8 Abundance heatmap of plankton communities in surface water from the Laoshan Area |
对样本中的物种进行Alpha多样性分析，各样本的Chao、Shannon和Simpson多样性指数以及覆盖度如表 5所示。各采样点中，最高Shannon指数出现在白沙河，最低出现在书院水库；最高Simpson指数出现在大石村水库，最低出现在白沙河。各样本覆盖度范围为0.999 5~1.000 0，这表明检测结果基本覆盖了全部物种。
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表 5 崂山区地表水各样本Alpha多样性指数 Table 5 Alpha diversity index of surface water in Laoshan area |
本次调查发现，调查水库中浮游植物主要类群以绿藻和蓝藻为主，而白沙河中浮游植物主要类群以硅藻、绿藻为主，造成差异的原因可能与不同水域水文特点相关。绿藻和蓝藻更适合在静止或水流较弱的环境中生长，而硅藻具有坚硬的硅质外壳，耐磨性较强，因此能够在水体流动较强的环境下获得较大的增殖优势[21-22]。在浮游动物中，有研究[23]发现其种类组成以轮虫种类最多，其次是桡足类和原生动物，且生物量和丰度较大，而枝角类种类较少，生物量和丰度较小。这可能是调查区域内，轮虫喜食的绿藻丰度较高，有利于轮虫的生长繁殖。此外，轮虫类与枝角类生态位较接近，存在激烈的竞争关系。当水体中轮虫类丰度较高时，会对枝角类产生抑制作用，从而降低枝角类的丰度和生物量[24]。比较不同调查区域的调查结果发现，水库中的浮游动物丰度和生物量明显高于白沙河，这可能是由于浮游动物在生态系统生物生产中起到“蜂腰控制”作用，其现存量分别受到浮游植物(上行效应)和鱼类(下行效应)的控制。水库水体流动较缓，有利于营养盐浓度的增加，可通过调节浮游植物的密度使浮游动物保持较高的生物量水平[25]。同时，水库也是良好的鱼类栖息地，大量滤食性鱼类的捕食作用使水库中的枝角类和桡足类现存量明显低于白沙河。
物种的种类组成、现存量和多样性指数等是检测水体营养状态和水质优劣的重要指标[26]。研究表明，浮游生物的丰度与水质密切相关，例如，当浮游动物丰度小于1 000 ind./L且生物量小于1.0 mg/L时，水体处于贫营养状态；当丰度大于2 000 ind./L且生物量大于3.5 mg/L时，水体处于富营养状态[27]。本研究中的浮游动物调查结果显示：除大石村水库外，其他调查区域浮游动物丰度均远低于1 000 ind./L，这说明水体贫营养状态，水质较好；大石村水库浮游动物丰度略高于1 000 ind./L，这说明水体接近贫营养状态。调查区域内浮游动物生物量的空间分布特征与丰度结果基本一致。此外，多样性指数是衡量群落物种数量、反映一定区域内生物资源丰富程度的重要指标[28-29]。基于生物多样性分级评价标准进行调查发现，调查区域内不同水库、河流的生物多样性存在一定的差异。从不同类群来看，调查区域内浮游植物生物多样性等级可描述为较好，浮游动物多样性等级可描述为一般；从不同水体来看，水库中浮游动物、植物多样性较为接近，而在河流中则表现为浮游植物多样性明显高于浮游动物，这是因为与河流相比，水库水体更趋于平缓，营养丰富且生境简单，更有利于水生生物栖息。
eDNA技术在生物多样性调查方面具有节省成本、环境友好的特点，且鉴定结果中的物种种类和丰度较传统形态学检测的结果更高[30-31]。本研究将采用eDNA技术的鉴定结果与传统形态学检测鉴定结果进行对比发现，利用eDNA技术鉴定出的浮游植物种类数显著低于传统形态学检测的结果，而鉴定出的浮游动物种类数明显多于传统形态学检测的结果。原因在于传统的网具采样方法是直接捕获目标物种，当调查区域的水域面积较大时，采样点难以全面覆盖，采集的样本无法完整地反映出调查区域的真实情况；而eDNA技术采集的样本源自整个调查区域内不同生物体释放到环境中的生物尸体、排泄物和皮肤细胞等，因此调查结果更为全面。但是由于eDNA技术依赖于物种特异性基因的分析，相较于鱼类等高营养级生物，已有的浮游植物的数据资料不够全面，导致可鉴定出的物种数量较少。此外，采用eDNA技术得到的浮游生物种类组成与传统形态学检测的结果相似，且优势属结果相似性较高，说明eDNA技术在浮游生物多样性调查上具有可靠性，且调查过程中避免了与目标物种的直接接触，这展现了其环境友好的优势，与传统形态学检测相比，降低了生物多样性调查工作中对生态系统的干扰。
虽然eDNA技术在水生生态系统多样性评估方面具有巨大的发展潜力，但也面临着一定的挑战：(1)目前关于浮游生物数据库的完整性和准确性仍需进一步提高。在本次调查中，虽然部分通过eDNA技术鉴定出的浮游生物种类数远高于传统方法，但存在较多未定种的基因型，因此数据库优劣会直接影响eDNA技术在物种检测上的精准性。(2)由于环境中的DNA在水体中留存的时间有限，不同的环境因子均会对DNA降解产生影响，这将加大检测结果的不稳定性。(3)由于eDNA技术是通过环境中生物的DNA来鉴定物种的存在，因此无法进一步检测生物的生理状态和年龄结构[32]。综上所述，eDNA技术目前在生物多样性检测中还无法完全取代传统形态学检测方法，只能作为重要的补充手段，在调查区域大、采样点无法有效完全覆盖时，eDNA技术可减少对生态系统的干扰，降低调查成本，增加调查结果的准确性。
4 结论(1) 在本研究调查区域，通过传统网具捕捞方法鉴定出浮游植物109种，隶属于7门、10纲、35科、61属，其中，水库中主要类群以绿藻和蓝藻为主，白沙河中主要类群以硅藻、绿藻为主；通过该方法鉴定出浮游动物54种，隶属于5纲、22科、31属，各类群中均以轮虫种类为最多，其次是桡足类和原生动物。而通过eDNA技术鉴定出浮游植物69种，隶属于2门、7纲、14目、25科，38属，以微拟球藻、金色藻和隐藻为优势属；鉴定出浮游动物84种，隶属于2门、2纲、3目、15科、24属，以多肢轮、异尾轮虫和秀体溞为优势属。
(2) 综合浮游生物丰度及多样性特征进行评价，调查区域内大部分水体的营养状态保持良好，基本处于贫、中营养状态，生物多样性表现良好。
(3) eDNA技术具有成本低和检测效率高的优势，可以为低营养级浮游生物多样性检测提供新的选择，但仍无法完全代替传统调查方法。因此，在实际检测工作中，需将两者结合使用，以实现对浮游生物多样性更全面、准确的检测。
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