2025, Vol. 55
2. 青岛海洋科技中心海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 青岛市食品生物技术重点实验室, 山东 青岛 266404;
4. 中国轻工业水产品生物加工重点实验室, 山东 青岛 266404
海藻酸(Alginate)又称藻酸、褐藻胶，是一种天然多糖类化合物，是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)单元通过1, 4-糖苷键形成的嵌段共聚物[1-2]。海藻酸在食品和生物医药领域有广泛的应用，作为一种天然可食用膳食纤维，海藻酸具有预防肠胃疾病、缓解肥胖等功能[3-4]；具备热量低、柔韧性高的特点，可用作食品中的乳化剂、定型剂等[5-6]；可以与钙离子反应发生热不可逆的凝胶化，形成可食用凝胶[7]，其中M单元与G单元的组成决定了海藻酸的结构，进一步影响海藻酸的生化特性[8]。高G含量海藻酸盐凝胶刚性越好，而高M含量水凝胶弹性越佳，可应用于不同功能需求的医药材料制备[9-10]。
目前，工业生产海藻酸的原材料主要是褐藻类，使用的主要方法是碱提法[11]。随着全球市场对于海藻酸的需求量越来越大，与之相关的原料养殖业及其传统提取行业所引发的海水富营养化、生产环境污染、能量损耗较大等环境问题也日益凸显[12]。因此，微生物法发酵生产海藻酸由于污染小、成本低等优点吸引了研究者的目光[13-15]。自然界中能够产海藻酸的微生物主要有固氮菌属(Azotobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)。其中安全性更高的以棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)为代表的固氮菌是目前研究最多的菌种[16]。固氮菌发酵生产海藻酸具有较大的生产潜力，但目前其生产能力较低。表 1总结了目前部分固氮菌发酵产海藻酸的研究情况[17-21]，可以看出现有的研究主要通过对固氮菌的培养基碳源等进行优化，虽然提高了海藻酸的生产能力，但是由培养基所产生的发酵成本仍旧较高[22]。相较培养基优化的方法，研究固氮菌的发酵工艺条件(温度、溶氧、时间等)，可在不增加碳源成本的基础上提升海藻酸生产效率，对微生物法发酵产海藻酸技术的发展将具有重要意义。因此，本研究为了提升棕色固氮菌ATCC 9046的海藻酸生产能力，针对发酵初始pH、温度、摇床转速和时间等关键条件的影响，通过单因素实验和响应面优化，确定了ATCC 9046的最佳发酵条件，最终实现了ATCC 9046海藻酸生产效率的提高。同时，还对发酵制备的海藻酸结构进行了测定，分析了海藻酸的分子量、单元组成及嵌段结构等特性，为细菌源海藻酸的应用提供了一定的理论参考。
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表 1 部分固氮菌发酵产海藻酸情况 Table 1 Fermentation of alginate by some Azotobacter strains |
试剂：海藻酸钠、四硼酸钠、硫酸、间羟基联苯、氨基磺酸、氢氧化钠、盐酸、三氟乙酸(TFA)、醋酸钠、硝酸钠、叠氮化钠、甘油均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甘露糖酸钠和古罗糖醛酸钠为分析纯，购自青岛博智汇力生物科技有限公司；甲醇(色谱级)购自上海麦克林生物科技有限公司；重水购自sigma公司。
主要仪器：BCM-1000生物超净台(苏州净化设备有限公司)，ZQZY-88BE恒温摇床(知楚生物科技有限公司)，PHS-2F pH计(上海精科仪器有限公司)，5804R冷冻离心机(德国艾本德股份公司)，ICS 5000+离子色谱仪、MULTISKAN Sky酶标仪和UltiMate 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，AVANCE III HD600核磁扫描仪(德国Bruker公司)。
1.2 菌株与培养基菌株：棕色固氮菌ATCC 9046(A. vinelandii ATCC 9046)，购自ATCC菌种中心(American Type Culture Collection)。
固氮菌培养基(上海瑞楚生物科技有限公司)：0.8 g/L磷酸氢二钾，0.2 g/L磷酸二氢钾，0.2 g/L七水合硫酸镁，0.1 g/L二水合硫酸钙，0.01 g/L三氯化铁，0.002 g/L二水合钼酸钠，0.5 g/L酵母膏，20 g/L甘露醇，1.5%~2% 琼脂粉(配制固体培养基时添加)。培养基经121 ℃条件下灭菌20 min后使用。
1.3 实验方法 1.3.1 海藻酸含量测定采用改良间羟基联苯法测定发酵液中海藻酸含量[23]，分别吸取100 μg/mL海藻酸钠标准液0、200、400、600、800和1 000 μL于15 mL具塞刻度试管中(每组三个平行)，分别加超纯水使得体系补至1 000 μL。所得系列标准溶液中的海藻酸钠含量依次为0、20、40、60、80和100 μg。再向装有各浓度梯度海藻酸钠标准液的试管中加入10 μL 4 mol/L氨基磺酸盐溶液(38.9 g氨基磺酸溶于氢氧化钠溶液中，pH调至1.6)，将试管置于冰水浴中，缓慢沿管壁滴加6 mL 4.8 mg/mL四硼酸钠-硫酸溶液，待全部滴加完毕后，再将试管置于100 ℃水浴加热5 min，加热完毕后待溶液自然冷却至室温，加入100 μL 1.5 mg/mL间羟基联苯溶液用于显色，室温下静置10 min使得显色剂与显色物质充分结合，吸取200 μL于96孔板，用酶标仪测量溶液在520 nm波长处的吸光度，将所得数据绘制标准曲线，用于后续发酵液中海藻酸含量的计算。
1.3.2 棕色固氮菌ATCC 9046初始海藻酸生产能力测定取保藏于-80 ℃冰箱的棕色固氮菌ATCC 9046甘油管进行划线培养，挑取单菌落于5 mL固氮菌液体培养基中30 ℃、200 r/min条件下活化培养至OD600为0.6~0.8。再取1 mL活化菌液加入到50 mL(250 mL锥形瓶)固氮菌液体培养基中，在30 ℃、200 r/min条件下培养120 h。每隔24 h取1 mL发酵液用于测量OD600，再取1 mL发酵液溶于9 mL超纯水，混匀后在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，将1 mL离心后上清液用于海藻酸产量的测定，方法见1.3.1。
1.3.3 棕色固氮菌ATCC 9046发酵产海藻酸单因素实验(1) 初始pH：用1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸溶液调节固氮菌培养基初始pH分别为3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，取1 mL活化菌液加入到50 mL(250 mL锥形瓶)固氮菌液体培养基中，在温度30 ℃、摇床转速200 r/min下发酵120 h，每隔24 h取样2 mL用于测量OD600及发酵液中海藻酸含量；(2)发酵温度：调节初始pH为7.0，取1 mL活化菌液加入到50 mL(250 mL锥形瓶)固氮菌液体培养基中，分别在10、20、30、40和50 ℃条件下，使用摇床转速200 r/min发酵120 h，每隔24 h取样2 mL用于测量OD600及发酵液中海藻酸含量；(3)摇床转速：调节初始pH为7.0，取1 mL活化菌液加入到50 mL(250 mL锥形瓶)固氮菌液体培养基中，分别在转速为0、50、100、150和200 r/min条件下，温度30 ℃发酵120 h，每隔24 h取样2 mL用于测量OD600及发酵液中海藻酸含量。
1.3.4 棕色固氮菌ATCC 9046发酵产海藻酸响应面优化根据单因素实验结果，以发酵液中的海藻酸含量作为响应值，建立棕色固氮菌ATCC 9046四因素五水平的中心复合实验，各因素及水平设计如表 2所示。
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表 2 ATCC 9046中心复合实验设计因素水平表 Table 2 Factors and levels of the ATCC 9046 central composite design |
取保藏于-80 ℃冰箱的棕色固氮菌ATCC 9046进行划线培养，挑取单菌落于5 mL固氮菌液体培养基中活化至OD600为0.6~0.8，将200 μL活化后菌液涂布于平板上，培养72 h后，刮取菌落并用超纯水振荡悬浮，将悬浮液置于50 mL离心管中4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，收集上清，并进行冷冻干燥，收集海藻酸。
1.3.6 海藻酸的单糖组成测量称取5 mg细菌源海藻酸或1 mL标准品溶液(甘露糖醛酸钠或古罗糖醛酸钠)，缓慢加入1 mL 2 mol/L TFA酸溶液，待样品充分溶解后，置于121 ℃高温烘箱中加热2 h。取出酸解样品，用氮气进行吹干，再加入甲醇清洗后吹干，以去除残留TFA，清洗步骤重复3次。将干燥样品加入超纯水复溶，使用0.45 μm有机滤膜除去杂质，进行上机检测。色谱系统采用的是Thermo ICS 5000+离子色谱系统(ICS 5000+，Thermo Fisher Scientific，USA)，采用DionexTM CarboPacTM PA20(150 mm×3.0 mm，10 μm)液相色谱柱，进样量为5 μL，使用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。流动相A：0.1 mol/L氢氧化钠，流动相B：0.1 mol/L氢氧化钠与0.2 mol/L醋酸钠的混合溶液，流动相C：超纯水，总体流速为0.5 mL/min；液相柱恒温为30 ℃；洗脱梯度为：0~26 min(5∶0∶95，V/V/V)，26~42 min(5∶10∶85，V/V/V)，42~52 min(0∶40∶60，V/V/V)，52~52.1 min(40∶0∶60，V/V/V)，52.1~结束(5∶0∶95，V/V/V)。
1.3.7 海藻酸分子量测量将提取的海藻酸样品溶解于0.1 mol/L硝酸钠水溶液(含0.02%叠氮化钠, W/W)中，终浓度为1 mg/mL，并通过孔径为0.45 μm的水相滤膜过滤后上机检测。色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，液相系统为U3000(Thermo, USA)，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatt technology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOS Ⅱ(Wyatt technology，CA，USA)。采用凝胶排阻色谱柱Ohpak SB-805 HQ(300 mm×8 mm)和Ohpak SB-803 HQ(300 mm×8 mm)串联。液相色谱柱恒温为45 ℃，进样量为100 μL，流动相D(0.02% 叠氮化钠与0.1 mol/L硝酸钠的混合溶液)，流速0.6 mL/min，等度洗脱75 min。
1.3.8 海藻酸嵌段组成测定取5 mg海藻酸冻干粉末溶于0.5 mL重水，进行1H NMR检测。检测条件如下：脉冲程序为zg30，测试温度为80 ℃，扫描宽度为5 000 Hz，扫描延迟为2 s，扫描次数为64次。
1.4 数据处理实验数据用平均值±标准误表示，使用Graphpad Prism 9.0软件进行数据处理和绘图，使用Design-Expert 13软件设计响应面实验和数据处理。
2 结果与分析 2.1 棕色固氮菌ATCC0946初始海藻酸生产能力将购买的棕色固氮菌ATCC 9046进行培养并测定其初始海藻酸生产能力，生长情况和海藻酸产量结果如图 1所示。当发酵到72 h时，ATCC 9046的海藻酸产量达到最大值1.2 g/L，OD600为0.6，而当发酵时间不断延长至120 h，海藻酸产量和生长情况均基本维持稳定。与同样以甘露醇为碳源，采用棕色固氮菌NCIB 9068发酵产海藻酸(产量为0.8 g/L)的研究结果相比，本研究的海藻酸产量更高[24]。
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图 1 ATCC 9046发酵产海藻酸 Fig. 1 Alginate production by ATCC 9046 through fermentation |
本研究首先针对发酵初始pH对棕色固氮菌ATCC 9046的生长及海藻酸的生产能力的影响进行了探究，结果如图 2所示。结果表明过高或者过低的初始pH，都会影响棕色固氮菌ATCC 9046的生长及海藻酸的生成，在微碱条件下即初始pH为7.0~9.0，棕色固氮菌ATCC 9046有着较为良好的生长情况以及较高的海藻酸产量。Clementi等[25]的研究也表明，pH与海藻酸的分泌及固氮菌生长有着紧密的联系，当初始pH低于5.5时，几乎不产海藻酸，与本结果相吻合。
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( (a) 海藻酸含量；(b) 菌体生长状态。(a) Alginate content; (b) Cell growth status. ) 图 2 初始pH对ATCC 9046的生长及产海藻酸能力的影响 Fig. 2 Effect of initial pH on the growth and alginate production capacity of ATCC 9046 |
发酵温度是影响微生物的生长及代谢较为关键的因素，因此本文又探究了温度对棕色固氮菌ATCC 9046的生长及产海藻酸能力的影响规律，结果如图 3所示。结果表明温度对棕色固氮菌影响较大，30 ℃条件下生长较佳，海藻酸的生产能力也较为合适。20 ℃及以下的低温条件，固氮菌几乎不生长，而当温度高于30 ℃时，菌体生长活力明显下降，海藻酸的产量也不断降低。Chen等[26]对A. vinelandii NCIB 9068的一株突变株发酵温度进行了优化，发现34 ℃时海藻酸产量最高。
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( (a) 海藻酸含量；(b) 菌体生长状态。(a) Alginate content; (b) Cell growth status. ) 图 3 发酵温度对ATCC 9046的生长及产海藻酸能力的影响 Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the growth and alginate production capacity of ATCC 9046 |
摇床转速主要影响发酵液中的溶氧量，从而影响微生物的生长等情况。摇床转速对ATCC 9046的生长及产海藻酸的影响结果如图 4所示。可以看出随着摇床转速的提高，细菌源海藻酸的产量也在提高，当转速达到150 r/min后，产量相对趋于稳定，这可能与溶氧相对充足有关。相似地，Chen等[26]也报道了A. vinelandii NCIB 9068突变株在170 r/min条件下发酵产海藻酸最佳。
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( (a) 海藻酸含量；(b) 菌体生长状态。(a) Alginate content; (b) Cell growth status. ) 图 4 摇床转速对ATCC 9046的生长及产海藻酸能力的影响 Fig. 4 Effect of shaker speed on the growth and alginate production capacity of ATCC 9046 |
选择合适的发酵时间将有利于控制发酵成本。结合图 2、3和4结果可以看出发酵时间对ATCC 9046的生长及产海藻酸的影响，发酵液中海藻酸的含量基本呈先上升后相对稳定的趋势。海藻酸的含量是发酵过程复杂的动态变化的综合结果体现，随着发酵时间的延长，代谢产物海藻酸逐渐积累，含量不断上升，而当发酵进入后期，随着发酵液中营养物质逐渐减少，棕色固氮菌ATCC 9046将重新吸收小部分合成的海藻酸，会导致发酵液中海藻酸的含量出现小幅度下降，而随着发酵进入末期，细菌的大量死亡也会致使细胞中的海藻酸释放到发酵液中，继而又呈现出海藻酸小幅度回升现象[27]。根据单因素实验初步优化的结果，进一步开展响应面设计，以获得海藻酸生产的最佳发酵条件。
2.3 棕色固氮菌ATCC 0946发酵产海藻酸响应面优化综合单因素实验的结果，选择初始pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，发酵温度为30、31、32、33和34 ℃，摇床转速为100、150、200、250和300 r/min，发酵时间为72、96、120、144和168 h，进行四因素五水平中心复合实验，对固氮菌的发酵工艺优化做进一步具体探索。按照设计组的参数条件进行发酵并测定了海藻酸含量，统计结果如表 3所示。对各个回归拟合分析后，最终获得回归方程为：Y=0.814 7-0.021 3×A-0.022 8×B+0.059 7×C+0.442 4×D-0.056 5×AB+0.013 5×AC+0.010 5×AD-0.006 1×BC+0.015 4×BD-0.001 1×CD+0.051 0×A2+0.057 0×B2+0.086 6×C2+0.107 1×D2。回归模型R2=0.938 7，RAdj2=0.881 4，RPre2=0.685 3，回归模型P＜0.001，回归方程模拟达到极显著，失拟项p=0.123＞0.05，失拟项不显著，表明实验所得回归方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，该回归方程模拟棕色固氮菌ATCC 9046四因素五水平的中心复合实验分析结果是可靠的。
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表 3 ATCC 9046中心复合实验设计与结果 Table 3 Central composite design and results of ATCC 9046 |
方差分析结果表明，影响海藻酸产量因素按照主次排序为：发酵时间(D)＞摇床转速(C)＞发酵温度(B)＞初始pH(A)。通过回归模型计算所得优化条件为初始pH=8.5，发酵温度31 ℃，摇床转速250 r/min，发酵时间144 h，预测海藻酸产量为2.0 g/L。以此优化条件为最终发酵条件，进行了三次固氮菌发酵实验，所得海藻酸产量为(2.00±0.03) g/L，与预测值十分接近，说明该回归模型合理。通过发酵条件的优化，海藻酸产量相较原始条件提高了66.7%，提升效果较为明显。此外，本研究结果与Díaz-Barrera等[19]报道的优化氧气传输速率后产海藻酸1.5 g/L结果相比，海藻酸产量提高了33.3%。值得一提的是，本研究涉及的发酵优化是在不改变原基础发酵培养基前提下进行的工艺优化，即在不增加培养基成本的前提下，有效改善了固氮菌的海藻酸合成效率，相较其他的研究结果在发酵成本上有一定的优势[28]，本研究成果将为微生物发酵合成海藻酸工艺的放大应用提供一定的理论基础。
2.4 棕色固氮菌ATCC 9046所产海藻酸单糖组成、分子量和嵌段组成通过高效液相测定了ATCC 9046所产海藻酸的糖单元组成，结果如图 5所示，计算得单糖组成M/G为11.9，其M残基含量显著高于天然海带来源的海藻酸M/G值(0.2~1.7)[29]，这为高M含量的海藻酸合成提供了途径。ATCC 9046所产海藻酸分子量测定结果如图 6所示，确定了ATCC 9046来源海藻酸分
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( (a) 标准品，G为古罗糖醛酸钠，M为甘露糖醛酸钠；(b) ATCC 9046发酵产海藻酸水解样品。(a) Standards, G is G-guluronic acid, M is M-mannuronic acid; (b) Alginate hydrolysates derived from ATCC 9046. ) 图 5 标准品及ATCC 9046发酵产海藻酸水解样品高效液相图 Fig. 5 HPLC results of standards and alginate hydrolysates derived from ATCC 9046 |
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图 6 ATCC 9046来源海藻酸的绝对分子量峰图 Fig. 6 Absolute molecular weight peak result of alginate derived from ATCC 9046 |
子量为255.0 kDa，大于从海带中提取的海藻酸分子量(48~186 kDa)[30]，适于特定大分子量的海藻酸制备。此外，根据Grasdalen等[31]报道的1H NMR方法分析海藻酸钠序列，确定M和G片段中各质子峰位移情况，结果如图 7所示。结果表明，ATCC 9046所产海藻酸包含GG、MG和MM三种嵌段，其组成与海带来源的海藻酸结构类似。固氮菌与海带所产海藻酸的结构差异，可能与不同的物种的海藻酸合成调控机制，宿主生长环境及提取工艺等差异有关[32]。Urtuvia等[33]报道了固氮菌属所产的海藻酸M单元含量范围为0.44~0.92，G单元的含量范围为0.08~0.56，海藻酸分子量范围为60~2 500 kDa，本研究所提取海藻酸单糖组成与分子量均符合此范围。
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图 7 ATCC 9046来源海藻酸嵌段组成 Fig. 7 Block compositions of alginate derived from ATCC 9046 |
本文以棕色固氮菌ATCC 9046为研究对象，通过单因素实验及四因素五水平响应面方法进行了海藻酸发酵工艺优化，在不增加培养基成本的前提下，实现了海藻酸生产能力提升66.7%，改善了棕色固氮菌海藻酸产能较低的现状。此外，本研究制备的海藻酸相较海带源海藻酸具备分子量更大、M/G比值更高等特点，适于高M型海藻酸的制备和应用。后续研究将深入探索棕色固氮菌ATCC 9046的海藻酸合成机制，借助代谢工程等手段进一步提升海藻酸生产能力，为微生物发酵产海藻酸技术的发展提供理论支撑。
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2. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. Qingdao Key Laboratory of Food Biotechnology, Qingdao 266404, China;
4. Key Laboratory of Biological Processing of Aquatic Products, China National Light Industry, Qingdao 266404, China