2024, Vol. 54
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237;
3. 江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005;
4. 莆田市水产研究所，福建 莆田 351100
温度、盐度和密度是影响海洋贝类生长的重要环境因子[1-6]。温度与贝类胚胎发育及早期幼虫的生长、发育、摄食等生命过程密切相关[2, 7]，例如，在13~33 ℃范围内，温度对香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)的滤水率、摄食率和吸收率的影响极显著[8]。研究表明，盐度变化不仅直接影响栉江珧(Atrina pectinate)胚胎发育及早期幼虫的摄食和代谢，而且对渗透压调节相关的Na+/K+-ATP酶活性影响尤为显著[2, 9-10]。密度过高会导致养殖个体之间对空间和食物的竞争，也是影响贝类等其他水产动物早期生长和存活的重要因素[5, 11-13]，例如，密度过高引起青蛤(Cyclina sinensis)体腔液中异养细菌和弧菌的数量显著上升，导致早期生长速度下降，死亡率显著升高[13-14]。在潮间带，温度、盐度和pH等是影响菲律宾蛤仔生长和存活的重要环境因子[1]。目前，有关贝类生长环境因子研究大部分都集中在单因子或双因子，而多种环境因子及其相互作用对贝类生长和存活的影响尚不明确。
响应面法(Response surface methodolody, RSM)是解决多变量因子问题的一种重要统计方法，利用合理的实验设计方案，可降低实验次数、优化各变量因子，是开展多因子及其互作效应研究的重要手段[15]。在响应面法分析过程中，利用Design-Expert 12软件结合Box-Behnken Design实验设计方案，对得到的数据进行统计分析，通过拟合曲线建立数学模型，可直观地反映实验因素和响应值之间的关系。目前，响应面法是研究多种环境因子对贝类生长和存活影响的重要手段[1, 6, 12]。
菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)隶属于软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科, 广泛分布于朝鲜、日本及我国沿海[16]。菲律宾蛤仔肉质鲜美、营养丰富，深受国内外消费者喜爱。蛤仔是一种主要栖息在软泥砂底质中、营埋栖生活的滩涂贝类，具有生长速度快、养殖成本低和环境适应性强等特点，是我国重要的滩涂贝类养殖品种。我国是菲律宾蛤仔养殖大国，近年来年产量约400万t，蛤仔育苗和养殖是我国南北沿海渔业贝类经济的重要支柱产业之一[17]。在蛤仔产业，蛤仔苗种的稳定生产是蛤仔养殖业健康、可持续发展的关键。在蛤仔早期生长阶段，环境因子对蛤仔苗种的生长和存活具有重要影响[1, 18-19]。因此，提高贝类苗种产量，迫切需要掌握苗种生长的适宜温度、盐度和密度等环境因子。本研究以我国重要滩涂贝类菲律宾蛤仔为研究对象，采用响应面分析方法，探究温度、盐度、密度三因素及其相互作用对蛤仔稚贝生长和存活的影响，构建蛤仔稚贝在不同环境条件下的生长模型，以期获得蛤仔适宜的环境条件，为优化蛤仔苗种的培育管理、提高苗种的质量和产量提供理论指导和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 实验材料稚贝采集于福建莆田贝类育苗基地，由同一批次幼体培育而成。正式实验前室内暂养7 d，使用游标卡尺(精度为0.01 mm)随机测量100粒稚贝壳长，平均壳长(1.85±0.03) mm，45日龄。海水温度(18±1) ℃，盐度30±1。所用海水均经过砂滤后，300目筛绢网过滤，紫外线消毒0.5 h，并提前配制各实验组。
1.2 实验方法采用3 L塑料透明小桶培育稚贝，300 W可控温浸入式电子加热棒或冷水机控制海水温度(±0.5 ℃)，并使用电子温度计(±0.1 ℃)观测温度变化，采用小型充气泵对培育水体进行不间断充气。本实验采用的环境因子范围参考前期研究报道，使用软件Design-Expert 12进行BBD (Box-Behnken Design) 实验方案设计和响应曲面分析(RSM)[1, 18]。设计响应面3因素(温度、盐度、密度)、3水平(-1、0、1)的二次多项回归组合实验(见表 1和表 2)。一共14组，每组设置3个平行，实验容器为3 L透明小桶。养殖桶中放入活力好且规格一致的稚贝150枚(密度：1×104粒/m2)、450枚(密度：3×104粒/m2)和750枚(密度：5×104粒/m2)，置于塑料盒中进行水浴控温。
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表 1 响应面法实验设计 Table 1 Response surface method experimental design |
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表 2 响应面三因素三水平方案与实验结果 Table 2 Response surface three factors and three levels scheme and test results |
实验期间，温度升降依靠加热棒或冷水机进行水浴控温，循环水泵使温度均匀，水温从18 ℃开始，以1 ℃/2 h的速率升温或降温达到设定的实验温度。低盐海水通过向自然海水中添加过滤自来水配置，折射盐度计(ATAGO)测定盐度，精度为±0.1%。按±3/h的升降速率达到各自实验盐度。饵料投喂浓缩角毛藻(Chaetoceros calcitrans)，确保饵料密度为1×104个/mL。每天换水，换水量1/2，及时清理污物。在实验结束后用游标卡尺(精确度达0.01 mm)测量各组稚贝壳长和成活率。
2 结果 2.1 温度、盐度、密度及交互作用对蛤仔平均壳长的影响稚贝培育73 d后，不同实验组的平均壳长见表 2。随着温度的升高，壳长呈先上升后下降的趋势，温度对稚贝生长具有显著影响(P < 0.05，见图 1)；随着盐度的增加，壳长也呈先上升后下降的趋势，但影响不显著(P>0.05，见图 2)；随着密度的增大，蛤仔壳长呈先上升后下降的趋势，密度对稚贝生长具有显著影响(P < 0.05，见图 3)。温度32 ℃时，各组稚贝的平均成活率为(75.87±7.00)%，温度15 ℃时，各组稚贝的平均成活率为(96.16 ± 1.56)%，两者差异极显著(P < 0.01，见图 4)。然而，密度和盐度对稚贝的成活率影响不显著(P>0.05，见图 4)。Design-Expert分析结果显示，温度、盐度、密度的二次效应对稚贝生长影响极显著(P < 0.01)。响应面设计软件Design-Expert 12对壳长进行二元多次回归拟合，得到各环境因子间的相互作用对蛤仔生长的影响。等高线的形状反应了两个因素的交互作用，如等高线呈现椭圆型，则两个环境因素之间的有交互作用。等高线几乎呈圆形，则表明盐度、温度和密度之间的交互作用不明显(见图 5—7)，且方差分析结果也证实了因子间的交互作用不显著(P>0.05，见表 3)。
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(中间实线表示平均壳长，上虚线表示平均壳长最大值，下虚线表示平均壳长最小值。下图同。The middle solid line represents the average shell length, the upper dotted line represents the maximum average shell length, and the lower dotted line represents the minimum average shell length. Same as the picture below. ) 图 1 温度对蛤仔稚贝平均壳长的影响 Fig. 1 Effects of temperature on average shell length of juvenile clam |
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图 2 盐度对蛤仔稚贝平均壳长的影响 Fig. 2 Effects of salinity on average shell length of juvenile clam |
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图 3 密度对蛤仔稚贝平均壳长的影响 Fig. 3 Effects of density on average shell length of juvenile clam |
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(不同字母代表组间差异显著，(P < 0.05)。图右侧表格表示横坐标中1—14组各组的温度、盐度和密度条件。Different letters represent significant differences among species, P < 0.05). The table on the right side of the figure represents the temperature, salinity and density conditions for each of the groups 1—14 in the horizontal coordinates. ) 图 4 蛤仔生长73 d后各实验组的存活率 Fig. 4 Survival rates of clams in each experimental group after 73 days of growth |
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图 5 温度和盐度交互作用对蛤仔壳长生长影响 Fig. 5 Effects of the interaction of temperature and salinity on the growth of clam shell length |
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图 6 密度和温度交互作用对蛤仔壳长生长影响 Fig. 6 Effects of the interaction of density and temperature on the growth of clam shell length |
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图 7 密度和盐度交互作用对蛤仔壳长生长影响 Fig. 7 Effects of the interaction between density and salinity on the growth of clam shell length |
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表 3 壳长回归模型的方差分析 Table 3 Analysis of variance of the shell length regression model |
通过Design-Expert 12软件对壳长数据进行分析，建立二次响应面回归模型，分析结果见表 3。获得壳长预测值Y对编码自变量温度(T)、盐度(S)和密度(D)的二次多项回归方程：Y=-6.366+0.276T+0.584S+0.636D-0.0004 TS+0.002 8TD-0.000 6SD-0.005 66T2-0.013 7S2-0.115 9D2。式中：TS为温度与盐度的互作效应；TD为温度与密度的互作效应；SD为盐度与密度的互作效应；T2为温度的二次效应；S2为盐度的二次效应；D2为密度的二次效应；R2为模型的决定系数；Adjusted R2为模型的校正决定系数；Predicted R2为模型的预测决定系数。R2=0.787，Adjusted R2=0.306，Predicted R2=-2.415；模型的决定系数R2为0.787，说明总变异的22%不能用此模型解释。该模型不显著，所以需要进一步优化，优化后的结果见表 4。重新回归后的方程：Y=-6.331 05+0.276 5T+0.573S+0.689D-0.005 66T2-0.013 7S2-0.115 9D2, 式中：R2=0.781 6，Adjusted R2=0.594 4，Predicted R2=0.126 5；模型的决定系数R2为0.781 6，说明该模型能解释78.16%的变化，该模型达到显著性水平(P < 0.05，见表 4)。由方差分析可知，温度、盐度、密度对模型影响不显著(P>0.05)，但是温度、盐度、密度的二次项对模型的影响显著(P < 0.05)，其中盐度的二次项对模型产生的影响极显著(P < 0.01)；利用此模型在多因素条件下进行分析和预测，可计算出三因素下的最优条件: 温度为24.32 ℃，盐度为21.13，密度为2.88×104粒/m2，此时壳长可达最大值4.07 mm。
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表 4 剔除交互作用后的回归模型方差分析 Table 4 Analysis of variance of regression model after excluding interaction |
温度是影响海洋贝类生长的关键环境因子之一。菲律宾蛤仔是生活在潮间带的埋栖型贝类，其生长速度极易受到外界环境温度的影响[4, 6]。菲律宾蛤仔温度耐受范围广，适应温度范围为5~35 ℃，但最适宜生长的环境水温为15~30 ℃[18, 20]。本研究通过响应面法分析了温度、盐度、密度三个因子及其互作效应对蛤仔稚贝生长和存活的影响，结果表明蛤仔稚贝生长的最适温度为24.32 ℃，与已报道的最适生长温度25 ℃结果相近[1, 18]。大量研究表明，随着温度的升高，贝类早期生长呈先上升后下降的趋势，即表现出抛物线形的特征[1-2, 5-7, 21]。这与本实验的研究结果一致，在适宜温度范围内，蛤仔稚贝生长速度与温度呈正相关，但超出温度的适宜范围，生长速度会出现不同程度的下降。研究发现，大部分滤食性贝类，当温度在适宜范围内，随着温度的升高，可导致稚贝的摄食活动活跃，摄食量增加，从而导致稚贝的快速生长[4, 6, 8, 22-23]。然而，温度过高会加速水中微生物繁殖，降低水体溶氧量，从而影响稚贝的生长和存活[4, 24]。本研究结果也证实，高温会导致蛤仔稚贝的存活率显著下降。另外，剧烈的温度变化同样会影响贝类的代谢速率、血细胞和酶活等生理代谢，减弱机体免疫防御能力，从而影响贝类的生长和存活[4, 6, 25]。因此，本研究结果证实，在蛤仔苗种培育过程中，维持环境水温25 ℃左右，避免温度的剧烈波动，能够显著促进稚贝的生长和提高苗种成活率。
除温度外，盐度也是影响海洋贝类生长和存活的重要环境因子。作为长期生长在潮间带的埋栖型贝类，菲律宾蛤仔的生长和存活同样会受到盐度的影响。研究表明，菲律宾蛤仔生长适宜的盐度范围为14~27，但稚贝生长的最适盐度为20~23[1, 18, 20]。这与本实验中的多因子响应面法分析结果一致，本研究发现蛤仔稚贝在盐度21.13时生长速度最快，这进一步确定了蛤仔早期阶段的最适生长盐度。另外，本研究中发现蛤仔苗种生长速度随盐度增加呈先升高后降低的趋势，这与盐度对其他贝类生长速度的影响规律相似[1, 4, 6, 25-27]。在盐度的适宜范围内，贝类具有调节渗透压的能力，机体会根据水体盐度变化调节细胞膜上的Na+/K+-ATP酶来维持体内外平衡，从而影响贝类的新陈代谢、摄食率和免疫能力等生理特征[4, 6, 25]。然而，盐度过低或过高对贝类的新陈代谢和生长都具有不利影响[2, 12, 25, 28]。贝类长时间生活在过高或过低的盐度环境中，可导致渗透压调节失衡，直接影响贝类的存活[4]。在本研究中，高盐和低盐环境可能造成蛤仔体内的渗透压失衡，从而改变机体的新陈代谢，最终对其生长和存活造成不利影响。因此，在蛤仔苗种培育过程中，维持适宜的盐度(21~23)对于苗种的生长和成活尤为重要。
培育密度也是影响贝类苗种生长和存活的重要因子，培育密度的高低主要影响养殖贝类对空间和食物的竞争等，尤其对于蛤仔等埋栖型滩涂贝类[29]。本实验研究结果表明，在一定密度范围内，蛤仔苗种生长速度和密度呈正相关，壳长生长达到最大值，而密度过高会限制苗种的生长, 例如，对于蛤仔浮游幼虫，其最适培育密度为10个/mL，而过高密度会影响浮游幼虫的生长和附着变态[19]。本研究通过三因子实验的响应面法分析，揭示蛤仔苗种的最适培育密度为2.88×104粒/m2。研究发现，贝类的排泄物质(主要为含氮化合物)随着养殖密度的增高而增加，容易败坏水质，进而影响贝类的生长和存活[5]。本研究通过三因子实验结果进一步证实，过高的苗种培育密度可能直接导致苗种缺氧及其对空间和食物的竞争，这对于苗种的生长和存活是非常不利的。因此，在蛤仔苗种培育过程中，选择合理的培育密度(约3×104粒/m2)是十分必要的。
许多研究表明，当环境因子在合理范围内，温度和盐度的交互作用对贝类生长影响不显著，而当两者其中之一接近机体的耐受极限时，其互作效应才会显著影响贝类生长[1, 3-4, 12, 30], 例如，温度和盐度对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)幼贝生长和存活的影响存在显著互作效应，当盐度处于最适宜范围时, 幼贝最适温度范围最大; 而盐度接近耐受极限时, 幼贝的最适温度范围明显变小[31]；随着栉孔扇贝(Chlamys farreri)幼虫生长发育，其环境耐受力不断增强，温度和盐度偏离极端耐受值，两者相互作用对生长无显著影响[8]。然而，本研究结果表明，温度、盐度和密度的交互作用对蛤仔苗种生长影响不显著，可能由于各环境因子均设置在合理范围内，并未接近苗种生长的极限耐受值。因此，本研究通过设置合理的环境因子范围，结合三因子实验设计方案，建立了蛤仔苗种在不同环境下的生长模型，揭示各因子对苗种成活率的影响，研究结果对于蛤仔苗种培育具有重要的参考价值。
综上所述，本研究采用响应面法分析温度、盐度、密度及互作效应对蛤仔苗种生长和成活的影响，拟合获得壳长的二次响应面回归方程，通过生长模型得出最适环境因子：温度24.32 ℃，盐度21.13，密度2.88×104粒/m2。本研究获得了蛤仔苗种培育的最适环境条件，研究结果对于优化蛤仔苗种培育管理、提高蛤仔苗种产量具有重要的借鉴和参考价值。
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2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China;
3. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China;
4. Putian Fisheries Research Listitute, Putian 351100, China