2. 河南中医药大学第二临床医学院肝胆脾胃科三区, 河南 郑州 450046;
3. 河南中医药大学电镜中心, 河南 郑州 450046;
4. 河南医学高等专科学校病理学教研室, 河南 郑州 451191;
5. 河南中医药大学肝病研究所, 河南 郑州 450046
2. The Section Ⅲ of Hepatobilia-ry-Spleen-Stomach Department, The Second Clinical Medical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
3. Electron Microscope Center, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
4. Department of Pathology, Henan Medical College, Zhengzhou 451191, China;
5. Institute of Hepatology, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China
炎症是机体对生物性、物理性、化学性等因素造成的损伤产生防御反应。炎症反应的产生伴随炎细胞的渗出激活、吞噬免疫作用及炎症介质的合成、释放过程。炎症若迁延不愈，持续存在，便会呈现慢性炎症状态。研究[1-5]证实，慢性炎症与肝硬化、冠心病、糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关。巨噬细胞是慢性炎症时发挥免疫吞噬功能的关键细胞，能够产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)等炎症介质[6]。因此，研究巨噬细胞参与慢性炎症的作用机制，可以为进一步开发相应疾病的临床治疗药物提供重要参考。中药源自天然药材，在治疗慢性炎症性疾病方面具有独特优势。黄杞苷(engeletin，CAS号：572-31-6)是从多种药材中分离的黄酮类化合物，在减轻器官损伤、抗肿瘤、抗氧化方面有显著功效[7-9]。为了解黄杞苷的抗炎作用及机制，本研究用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠RAW264.7单核巨噬细胞构建炎症模型，观察黄杞苷对炎症因子产生和氧化应激水平的干预效果及分子机制，为黄杞苷的开发利用提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 细胞和试剂小鼠RAW264.7细胞株(中山大学病原生物学教研室馈赠)，热灭活胎牛血清(美国GIBCO公司，批号1892436)，黄杞苷(成都德思特生物技术有限公司，批号DST191028-045)，LPS、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲亚砜(DMSO)(北京索莱宝科技有限公司，批号530R059、715F056、1121E0323)。小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司，批号E20220501A、E20220601A、E20220601A)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物(superoxide，O2·-)、一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号41720200803、081420210429、11020200903、090419191224)。p65、GAPDH抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号10005701、10017731)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-IgG(H+L)抗体(成都正能生物技术有限公司，批号LL0310N)，p-p65和IκBα抗体(美国Cell Signaling公司，批号013346S000204122021、004814T001711182020)。
1.2 试验仪器细胞培养箱、低温离心机(均购自美国Thermo scientific公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，酶标仪、蛋白电泳仪、凝胶成像分析仪(均购自美国Bio-rad公司)，荧光全波长酶标仪(美国BioTek公司)，水平摇床(美国Scilogex公司)。
1.3 细胞培养及分组RAW264.7细胞采用含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖DMEM培养基，置于含5% CO2的37℃培养箱培养，细胞生长密度达80%后，用台盼蓝染色检测细胞存活率达94.25%，表明对数生长期细胞状态良好，可用于后续试验。细胞随机分为对照组、LPS组、不同浓度黄杞苷干预组，对照组给予完全培养基培养，LPS组给予含0.1 μg/mL LPS的完全培养基培养，黄杞苷干预组则是在含0.1 μg/mL LPS的完全培养基中加入不同浓度黄杞苷干预。
1.4 MTT细胞增殖检测及形态拍照取对数生长期的RAW264.7细胞按2×103细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，按照试验分组培养，并采用倒置显微镜观察细胞形态拍照记录。于不同培养时间进行MTT细胞增殖检测，在避光条件下加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液继续培养4 h，弃培养基后加入200 μL DMSO，置于水平振荡仪上快速振荡10 min使结晶物充分溶解，最后置于酶标仪检测各组OD490nm值并计算细胞增殖率，细胞增殖率=(试验组OD490nm－空白组OD490nm)/(OD490nm对照组－空白组OD490nm)×100%。
1.5 ELISA检测上清中TNF-α、IL-6和IL-1β浓度收集各组细胞12、24、36 h培养上清液，3 000 r/min离心后去除杂质，依照ELISA试剂盒说明，标准孔依次加入50 μL倍比稀释的标准品，空白孔加入50 μL样本稀释液，样本孔加入50 μL稀释5倍的培养上清液，除空白孔外，标准孔和样本孔加入HRP标记的抗体工作液100 μL，37℃温育1 h，甩尽孔内液体，洗涤5次后加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min，加终止液50 μL，终止反应后检测OD450nm值，根据标准曲线计算上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β浓度。
1.6 检测细胞产生的ROS、O2·-和NO 1.6.1 ROS检测细胞接种于12孔板培养24 h，依照ROS检测试剂盒说明，在阳性对照组孔内加入Rosup刺激30 min，其余孔按照预先分组培养，弃培养基后各孔加入50 μL 10 μmol/L DCFH-DA探针孵育20 min，用无血清培养基洗涤3次后，采用倒置荧光显微镜观察细胞ROS荧光并拍照，重复试验并将培养板置于荧光全波长酶标仪检测各组OD488/525nm值，ROS=(试验组OD488/525nm－空白组OD488/525nm)/(对照组OD488/525nm－空白组OD488/525nm)×100%。
1.6.2 O2·-检测细胞按预先分组接种于96孔板，LPS+黄杞苷组细胞给予不同浓度黄杞苷预处理24 h，对照组和LPS组不作预处理，弃培养基并用PBS漂洗2次，依照O2·-检测试剂盒说明，加入200 μL检测工作液37℃孵育3 min，随后LPS组和LPS+黄杞苷组加入LPS刺激20 min，置于酶标仪检测各组OD450nm值，因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可清除O2·-，以LPS孔中加入2 μL SOD作为有效标准验证整个检测体系。
1.6.3 NO检测收集各组24 h培养上清液样本，依照NO检测试剂盒说明，按50 μL/孔在酶标板中加入0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L NO标准品和各组上清液样本，随后依次加入Griess Reagent Ⅰ 50 μL/孔和Griess Reagent Ⅱ 50 μL/孔，检测OD540nm值并根据标准曲线计算各组NO浓度。
1.7 Westernblot检测IκBα、p65、p-p65蛋白表达提取各组细胞总蛋白并检测蛋白浓度，蛋白与5×loading buffer混合后煮沸变性，随后行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST漂洗5次，4℃孵育IκBα(1∶1 000)、p65(1∶2 000)、p-p65(1∶1 000)、GAPDH(1∶20 000)一抗过夜，TBST漂洗5次，室温孵育HRP-IgG H+L二抗(1∶5 000)1 h，TBST漂洗5次，采用ECL发光法成像仪显色，应用Image J软件进行灰度扫描。
1.8 统计学分析应用SPSS 22.0对数据进行统计学分析，试验数据以(x±s)表示，多组间比较采用ANOVA方差分析、Tukey检验方法和LSD检验方法，以P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同浓度黄杞苷对RAW264.7细胞增殖率的影响MTT结果显示，不同组别间细胞增殖率比较，差异有统计学意义(F=20.41，P＜0.001)；两两比较发现，LPS组较对照组细胞增殖增加(P＜0.001)，100、200、400、600、800 μmol/L黄杞苷均能抑制LPS诱导的细胞增殖(均P＜0.05)，其中400 μmol/L抑制效果最明显，因此后续试验均采取该浓度。见表 1。
| 表 1 不同浓度黄杞苷对RAW264.7细胞增殖率的影响(x±s，%) Table 1 Effect of different concentrations of engeletin on the proliferation rate of RAW264.7 cells (x±s, %) |
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MTT结果显示，时间和组别间有交互效应(F=6.95，P＜0.001)，尽管组别和时间对细胞增殖率影响比较，差异均有统计学意义(均P＜0.001)，但不能保证每个时间点的不同组别之间细胞增殖率均有差异。进一步做单独效应比较发现，在12、24、36、48和72 h这些时间点，LPS组较对照组细胞增殖增加(均P＜0.001)，LPS+黄杞苷组较LPS组细胞增殖减少(均P＜0.01)，说明400 μmol/L黄杞苷能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞增殖。见表 2。
| 表 2 400 μmol/L黄杞苷干预不同时间对RAW264.7细胞增殖率的影响(x±s，%) Table 2 Effect of 400 μmol/L engeletin on the proliferation rate of RAW264.7 cells at different intervention times(x±s, %) |
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倒置显微镜观察发现，LPS刺激后RAW264.7细胞数量增多，密度较高，呈抱团生长状态；400 μmol/L黄杞苷干预后，细胞生长受到抑制，密度减少，说明其对RAW264.7细胞生长具有抑制作用，见图 1。
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| 图 1 400 μmol/L黄杞苷对RAW264.7细胞生长状态的影响(100×) Figure 1 Effect of 400 μmol/L engeletin on the growth of RAW264.7 cells (100×) |
根据TNF-α、IL-6、IL-1β标准品浓度梯度和对应的OD450nm值生成标准曲线，利用标准曲线计算出各组TNF-α、IL-6、IL-1β浓度。结果显示，TNF-α、IL-6、IL-1β时间和组别间均无交互效应(均P＞0.05)，不同组别间TNF-α、IL-6、IL-1β差异有统计学意义(均P＜0.001)。两两比较显示，LPS刺激RAW264.7细胞后12、24、36 h，培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β均较对照组升高(均P＜0.05)；400 μmol/L黄杞苷干预12、24、36 h，培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β均较LPS组下降(均P＜0.05)，说明黄杞苷可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-6、IL-1β。见表 3。
| 表 3 400 μmol/L黄杞苷对TNF-α、IL-6、IL-1β生成的影响(x±s，pg/mL) Table 3 Effect of 400 μmol/L engeletin on the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β (x±s, pg/mL) |
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不同组别之间ROS、O2·-、NO释放量比较差异有统计学意义(均P＜0.001)。ROS检测结果显示，Rosup组(Rosup可刺激细胞产生ROS)和LPS组较对照组细胞荧光增多，ROS量增加(均P＜0.001)，说明LPS与Rosup作用类似，能刺激RAW264.7细胞产生ROS；而LPS+黄杞苷组较LPS组细胞荧光减少，ROS量下降(P＜0.05)，说明黄杞苷可抑制LPS诱导的ROS产生，见图 2和表 4。O2·-检测结果显示，LPS组较对照组细胞O2·-量增加(P＜0.001)；而LPS+SOD组(SOD可清除细胞产生的O2·-)和LPS+黄杞苷组较LPS组细胞O2·-量下降(均P＜0.01)，说明黄杞苷与SOD效果类似，能减少LPS诱导的O2·-产生，见表 4。NO检测结果显示，LPS刺激细胞24 h，NO量较对照组增加(P＜0.001)；而黄杞苷作用于细胞24 h，NO量较LPS组下降(P＜0.001)，说明黄杞苷可抑制LPS诱导的NO产生，见表 4。
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| 图 2 400 μmol/L黄杞苷对RAW264.7细胞ROS荧光的影响(400×) Figure 2 Effect of 400 μmol/L engeletin on the ROS fluorescence in RAW264.7 cells (400×) |
| 表 4 400 μmol/L黄杞苷对ROS、O2·-、NO释放的影响(x±s) Table 4 Effect of 400 μmol/L engeletin on the release of ROS, O2·- and NO (x±s) |
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Western blot结果显示，不同组别之间IκBα、p65、p-p65蛋白表达差异有统计学意义(均P＜0.05)。两两比较发现，与对照组相比，LPS组细胞IκBα蛋白表达水平下调(P＜0.01)，而p65蛋白、p-p65蛋白表达水平上调(均P＜0.05)；与LPS组比较，加入400 μmol/L黄杞苷干预后，IκBα蛋白表达水平上调(P＜0.001)，而p65蛋白、p-p65蛋白表达水平下调(均P＜0.05)，提示黄杞苷可干预NF-κB信号通路中IκBα、p65、p-p65蛋白的表达，见图 3和表 5。
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| 图 3 400 μmol/L黄杞苷对IκBα、p65、p-p65表达的影响 Figure 3 Effect of 400 μmol/L engeletin on the expression of IκBα, p65 and p-p65 |
| 表 5 400 μmol/L黄杞苷对IκBα、p65、p-p65蛋白表达的影响 Table 5 Effect of 400 μmol/L engeletin on the expression of IκBα, p65 and p-p65 |
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巨噬细胞是机体的天然免疫细胞，能够吞噬、清除衰老细胞和病原微生物，递呈抗原，并诱导免疫应答反应，具有维持内环境稳态、参与组织修复和抵御感染的重要作用[10]。LPS是革兰阴性菌细胞壁破裂释放的主要成分之一，进入体内可诱发炎症反应，激活巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，是临床上感染性休克的主要诱因。作为最常见的外源性细菌内毒素成分，LPS被广泛用于构建体外炎症模型。龙碧莹[11]用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后，细胞增殖能力增强，成功构建巨噬细胞炎症模型。本研究也发现LPS刺激后，RAW264.7细胞数量增多，密度增高，增殖能力增强。巨噬细胞主要在慢性炎症时大量聚集，发挥吞噬免疫作用，可被不同刺激物激活，并诱导M1型或M2型极化。M1型巨噬细胞可产生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等炎症介质，也是体内杀伤性分子O2·-、羟自由基(hydroxyl radical，·OH)、NO等ROS/活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)的重要来源，从而清除病原微生物，发挥防御功能[12]。本研究LPS刺激后RAW264.7细胞发生M1极化，TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、NO、O2·-增多，与前期研究[13-14]一致。其中，NO属于RNS，O2·-属于ROS，两者均可由内、外源性因素诱导产生。LPS作为内毒素的成分，除了诱导巨噬细胞增殖聚集，还能促进炎症细胞因子、ROS/RNS的释放，导致炎症病变时氧化应激水平升高。
黄酮类化合物是从多种中药材中分离的，具有抗菌消炎、抗氧化作用的药效成分，分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、异黄酮类、双黄酮类、查尔酮类及其他黄酮类等，能够治疗多种炎症性疾病。土茯苓总黄酮具有除湿解毒、疏通关节、减轻炎症的药理作用，可减轻痛风性关节炎小鼠的踝关节肿胀度[15]；菝葜总黄酮具有祛风消肿、解毒散瘀、抗炎抗菌的药理作用，能降低慢性盆腔炎大鼠子宫组织中IL-6和IL-1β水平，一定程度上改善慢性盆腔炎，缓解盆腔粘连[16]。本研究中的黄杞苷属于土茯苓(光叶菝葜)和菝葜(金刚藤)等菝葜属中药材分离的黄酮类化合物，也能减少LPS诱导的炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生，发挥重要的抗炎作用。此外，黄杞苷还能抑制LPS诱导的ROS/RNS产生。作为细胞氧化还原反应的代谢物，过多的ROS/RNS会引起细胞DNA、蛋白质和脂质的过氧化损伤，诱导细胞死亡[17]。谢雨露等[18]研究发现，黄杞苷通过直接或间接清除氮氧自由基减少ROS/RNS生成，具有重要的抗氧化作用。
抗炎、抗氧化的药物往往具有抑制氧化损伤、保护组织、细胞的功效。文献[19-21]证实，黄杞苷能够减轻LPS诱导的急性肝、肺损伤和子宫内膜炎，其机制与抑制NF-κB信号通路的激活，减少TNF-α、IL-6、IL-1β和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生或表达有关。NF-κB是一种广泛存在于细胞内的核转录因子，与类风湿性关节炎、牛皮癣、肠炎、肝纤维化等多种炎症性疾病的发生发展密切相关，是炎症反应和氧化应激级联作用的中心调控器[22-23]。炎症诱导因子LPS可与巨噬细胞表面的Toll样受体4(TLR4)结合，激活NF-κB信号通路，高效诱导细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1)、趋化因子、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)等的表达，启动炎症反应；炎症反应产生大量的ROS/RNS，导致氧化应激水平升高，有利于有效消灭和清除外源感染物[24-25]。黄杞苷缓解椎间盘退行性变、骨盆炎症性疾病、骨关节炎的作用也均与干预NF-κB信号通路有关[26-28]。因此，黄杞苷抑制巨噬细胞增殖，减少炎症细胞因子和ROS/RNS的产生，可能也是通过干预NF-κB信号通路实现。
综上所述，本研究发现黄杞苷可能通过干预NF-κB信号通路，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞增殖、炎症因子和ROS/RNS的产生，显示了其抗炎和抗氧化功效，为其治疗炎症性疾病的深入研究提供一定的依据和借鉴。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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