随着社会人口老龄化的日益加剧，慢性疾病患者不断增加，使得呼吸支持的临床应用日益广泛。由于多种因素的影响，接受呼吸机治疗的临床患者往往会继发呼吸机相关肺炎(ventilator-associa-ted pneumoniae，VAP)^[1]。VAP是指气管插管或气管切开患者接受机械通气48 h后或撤机拔管48 h内发生的肺炎，是重症患者常见的严重并发症，更是常见医院获得性感染，其临床诊疗较为困难，且患者病死率高^[1-2]。耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌是VAP的重要病原体，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)是重要组成之一^[2-4]。CRKP不仅呈现出多重耐药，近年来更进化出携带pLVPK-like毒力质粒的耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistance hypervirulent Klebsiella. pneumoniae，CR-hvKP)，严重威胁医院感染的防控效果^[5]。目前，新型冠状病毒全球蔓延，患者感染后主要受累器官是肺，病情危重时大多需接受机械通气治疗^[6]。为提高救治成功率，预防多重耐药菌导致的VAP是临床诊疗及医院感染防控中一项重要工作。因此，收集2019年1—12月某地区省级综合性三甲医院VAP患者下呼吸道标本分离的CRKP菌株，分析其感染与耐药情况、基因分型及毒力因子特征，为其医院感染防控提供实验室循证依据。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

2019年1—12月某地区某三甲医院VAP患者下呼吸道合格标本分离的非重复肺炎克雷伯菌(KP)，共计75株。

1.2 临床资料的收集

VAP诊断标准按照《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关肺炎诊断和治疗指南(2018版)》^[2]进行。剔除机械通气之前已发生肺部感染者，机械通气治疗48 h内出院或48 h内死亡以及临床资料不完整患者分离的菌株。最终纳入本研究共计56株KP。收集患者的基本临床资料，包括性别、年龄、基础疾病、机械通气时间、入住ICU时间及临床转归。本研究通过该院伦理委员会审查同意。

1.3 菌株鉴定及药敏试验

采用Microflex LT型质谱仪(德国BRUKER公司)进行菌株鉴定。阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、厄他培南、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、妥布霉素、亚胺培南及左氧氟沙星采用VITEK 2 Compact型分析仪(法国BioMérieux公司)进行药敏检测；美罗培南及头孢哌酮/舒巴坦采用纸片扩散法进行药敏检测，纸片为美国ThermoFisher公司产品。替加环素(美国Pfizer公司)应用微量肉汤稀释法进行药敏检测，结果按EUCAST标准(http://www.eucast.org)判定，其他药敏结果按美国临床实验室标准化协会(CLSI) 2019版标准判定^[7]。将对亚胺培南、美罗培南及厄他培南三者任意一种耐药的KP定义为CRKP^[7]，对上述三种药物均不耐药的KP定义为碳青霉烯非耐药KP(non-carbapenem-resistant KP，nCRKP)。

1.4 碳青霉烯酶表型及耐药基因检测

采用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)及EDTA改良灭活试验(eCIM)检测碳青霉烯酶表型^[7]。煮沸法提取CRKP菌株DNA模板，聚合酶链反应(PCR)检测常见碳青霉烯酶基因bla_KPC-2、bla_NDM-1、bla_IMP、bla_VIM、bla_OXA-48，引物序列及扩增条件参照文献[8]。扩增产物用含EB(0.2 μg/mL)1%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像观察结果。阳性产物送Sangon Biotech公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中比对查询。

1.5 荚膜wzi分型及毒力基因检测

煮沸法提取待测KP菌株DNA模板，PCR扩增wzi基因，引物序列及扩增条件参考文献[9]。扩增产物送Sangon Biotech公司测序后，登录Web数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)比对wzi型及相应荚膜血清型。扩增9种主要毒力因子(包括rmpA、rmpA2、iucA、iroN、entB、magA、mrkD、Kfu及ybtS)，引物序列及扩增条件参考文献[10-11]进行。扩增产物用含EB(0.2 μg/mL)1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像观察结果。挑选代表性阳性结果送Sangon Biotech公司测序，比对确认后作为阳性对照。

1.6 多位点序列分型

参照多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)网站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html)推荐序列合成7对管家基因检测PCR引物。扩增条件参考文献[8]。PCR产物送Sangon Biotech公司测序，登录Web数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)比对序列，明确待测菌株ST型。按照gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB顺序整理等位基因，并根据等位基因差异，将ST型分为单位点变异型(single-locus variants, SLVs)、双位点变异型(double-locus variants, DLVs)及三位点变异型(triple-locus variants，TLVs)。应用Global optimal eBURST(goeBURST)软件分析各ST间的进化发育关系并构建最小生成树，确定ST型中的group founder及sub-group founder，将group founder及其SLVs(两种及以上)定义为克隆群(clonal complex，CC)^[12]。

1.7 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

待测CRKP菌株接种于2 mL LB肉汤管，37℃震荡培养4 h，离心后用EC液混匀。加入等体积2%低熔点琼脂糖凝胶，混匀后注入模具制成胶块。胶块置蛋白酶K于50℃水浴过夜后，1×TE清洗4~6次。胶块切至5 mm大小后XbaI酶37℃酶切4 h。电泳条件为：0.5×TBE、14℃、6 V/cm、线性梯度5~35 s、22 h。染色成像后使用BioNumerics软件分析。PFGE图谱相似性>90%定义为同一分型(Pulsotype, PT)^[13]。

1.8 统计分析

药敏检测结果应用WHONET 5.6软件进行分析，其他统计应用SPSS 21.0软件进行。Shapiro-Wilk方法进行正态性检验，正态分布资料以x±s表示。两组定量数据均数比较采用t检验，两组样本率间的比较采用卡方检验，以P ≤ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 临床基本特征

本研究56株KP中，CRKP 34株(60.7%，CRKP组)，nCRKP 22株(39.3%，nCRKP组)。CRKP组患者以男性为主(70.6%)，平均年龄(62.3±16.4)岁。CRKP组患者所在临床科室包括：综合重症监护病房A(ICU_A，13株，38.2%)、呼吸重症监护病房(ICU_R，8株，23.5%)、综合重症监护病房B(ICU_B，6株，17.6%)，神经外科(3株，8.8%)、急诊重症监护病房(ICU_E，2株，5.9%)及呼吸内科和骨科(各1株，2.9%)。与nCRKP组相比，CRKP组患者在年龄、性别、接受外科手术、机械通气时间及基础疾病方面差异均无统计学意义。但CRKP组入住ICU日数≥ 20 d比例高于nCRKP组，同时死亡及自动出院患者的比例高于nCRKP组(均P < 0.05)，治疗病情好转比例低于nCRKP组(P < 0.01)。见表 1。

2.2 药敏试验及耐药检测结果

体外药敏试验结果显示，CRKP组菌株对常用抗菌药物耐药率高于nCRKP组(均P < 0.05)。CRKP对头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素的耐药率均为100.0%，仅对氨曲南耐药率为97.1%，对环丙沙星及左氧氟沙星耐药率均为94.1%；对阿米卡星、妥布霉素及庆大霉素的耐药率分别为70.6%、94.1%、94.1%。未检出耐替加环素的菌株。见表 2。经mCIM和eCIM检测，97.1%(33株)CRKP菌株mCIM试验为阳性，2.9%(1株)菌株eCIM为阳性。PCR检测表明，mCIM阳性菌株均携带bla_KPC-2，eCIM阳性株携带bla_NDM-1。

2.3 MLST及PFGE分型

MLST结果显示，34株CRKP菌株共分为6个ST型，主要为ST11(82.4%)；22株nCRKP菌株分为8个ST型，主要为ST11(45.4%)。见表 3。GoeBURST分析可见，CRKP菌株中，ST11及ST15均为sub-group founder，ST340为ST11的SLVs，ST14为ST15的SLVs，且ST15为ST11的TLVs；nCRKP菌株中，ST23为group founder，ST218与ST1265均为ST23的SLVs，ST111和ST412均为ST23的TLVs。ST23和ST218、ST1265共同构成CC23。见图 1。进一步通过PFGE分析显示，34株CRKP分为26个PT型，其中PT05、PT15、PT16、PT18和PT20型菌株分别为2、3、4、2、2株，且PT15及PT16型克隆株主要分布在ICU_A病区。见图 2。

2.4 荚膜wzi分型及毒力因子分析

荚膜wzi分型可见，CRKP菌株共分为5种荚膜型，以K64型为主(50.0%)，其次为K47型(38.3%)；nCRKP菌株则分为7种，以K47为主(40.9%)。K64型菌株在CRKP菌株中的比例高于nCRKP菌株(P < 0.01)，且PT05、PT15及PT16型CRKP菌株荚膜均属于K64型。毒力因子检测结果显示，CRKP菌株携带多种毒力因子，其中pLVPK-like质粒介导的毒力因子rmpA、rmpA2、iucA及iroN检出率分别为17.6%、44.1%、44.1%及47.1%，而rmpA2、iucA及iroN的检出率高于nCRKP菌株(均P < 0.05)，上述质粒介导的毒力因子主要由K64-ST11型CRKP菌株携带。见表 4、图 2。

3 讨论

作为临床常见条件致病菌，KP易于获得外源耐药基因并出现耐药表型，是医院感染重点防控的多重耐药菌。根据全国细菌耐药监测网统计数据^[14]显示，我国CRKP检出率逐年攀升，从2013年的4.9%上升至2018年的10.1%，临床流行趋势十分严峻。本研究56株KP中，CRKP的比率高达60.7%，与感染患者均存在ICU住院史有关。与我国某三甲医院2018年ICU CRKP临床分离率为63.7%，且主要来源于呼吸道标本的研究^[15]结果基本一致。本组资料中CRKP组患者入住ICU日数≥ 20 d的比例高于nCRKP组，进一步提示ICU是CRKP流行播散的重点科室。

入住ICU患者大多患有严重基础疾病，一旦继发CRKP感染，往往预后不良。研究^[16]表明，感染CRKP患者病死率远高于感染非耐药株患者。本研究中，CRKP组与nCRKP组VAP患者在年龄、性别及基础疾病种类方面差异均无统计学意义，但其死亡及自动出院患者比例远高于nCRKP组。其CRKP菌株呈现多重耐药表型，对除替加环素之外的所有临床常用抗菌药物耐药率均高于70%；所有菌株均产碳青霉烯酶，且以KPC-2为主。KPC-2属于A类丝氨酸β-内酰胺酶，其临床流行范围最广泛，通常由质粒携带在肠杆菌目细菌间水平传播^[17]。此类质粒常同时携带多种耐药基因，导致CRKP菌株表现为多重耐药，给临床抗感染治疗带来极大挑战^[17]。因此，严格落实医院感染防控措施，预防VAP患者发生CRKP感染更显得尤为重要。

ST11型是中国大陆地区CRKP的主要流行克隆群，占比在60%以上^[17]。比较基因组学研究^[18]表明，由于包括荚膜多糖合成位点在内的基因组片段发生的重组，导致该型出现不同的进化分支，从而呈现不同的荚膜分型。本研究中，ST11型CRKP菌株共分成K64和K47两种荚膜型，以K64型为主，且K64型CRKP的构成比高于nCRKP组(P < 0.05)。2013—2017年浙江地区一项回顾性研究发现，K64-ST11型CRKP在2016年取代了K47型，成为主要流行亚克隆。通过毒力因子检测发现，CRKP菌株携带的毒力因子比例较高，且其中rmpA2、iucA及iroN检出率高于nCRKP菌株^[19]。上述三种毒力因子均由pLVPK-like毒力质粒携带，是CR-hvKP的重要分子标志^[5]。而携带pLVPK-like质粒的K64型亚克隆，更易于在医院环境中存活^[19]。本研究PFGE分型结果显示，出现3例以上克隆传播的PT15和PT16型，均属于K64型ST11-CRKP，提示该亚克隆在医院环境中具有较强的定植及播撒能力，可能与携带pLVPK-like质粒后毒力增强相关。另一方面，由于本研究纳入研究的菌株及病例数量较少，且菌株来源为单中心，研究结果存在一定的局限性。后续将继续扩充研究中心并增加菌株数量，系统分析携带pLVPK-like质粒与CRKP菌株医院内定植播撒之间的关联性。

综上所述，本研究结果显示，K64-ST11型CRKP是临床VAP患者下呼吸道分离CRKP重要分子亚克隆。不仅表现为多重耐药，而且携带大量由pLVPK-like质粒介导的毒力因子。与对照组相比，CRKP组患者临床预后不佳。应加强临床、实验室及感染管理部门的协作，密切监控K64型ST11-CRKP菌株亚克隆的流行趋势，防控其导致的医院感染事件发生。