急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发病率与死亡率逐年升高，是造成心血管疾病患者死亡的重要原因^[1]。AMI的发病机制与遗传、炎症、氧化应激、细胞凋亡等相关，多种细胞因子在AMI病理进程中发挥重要作用。研究发现miR-34a与心肌损伤的发生密切相关，能够通过下调靶基因NAD – 依赖性去乙酰化酶sirtuin-1（NAD-dependent deacetylase sirtuin-1，sirt1）诱导心肌细胞凋亡 ^[2]。p53属于抑癌基因，可与miR-34a形成正反馈调控细胞增殖、凋亡，激活miR-34a/sirt1/p53信号可诱导耳蜗毛细胞凋亡^[3]。然而miR-34a/sirt1/p53在心肌细胞凋亡中的作用目前尚不清楚。川芎嗪属于中药川芎有效成分，在心肌缺血再灌注损伤中具有一定的保护作用，能够改善AMI患者术后心功能，缓解心室重构^[4]，然而其具体保护机制尚不清楚。本研究采用左冠状动脉前降支结扎法复制AMI大鼠模型，观察川芎嗪对AMI大鼠的心肌保护作用，探讨可能作用机制，旨在为川芎嗪临床应用提供理论依据。结果报告如下。

105只SPF级SD雄性大鼠，8周龄，体重200～220 g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，动物许可证号：SYXK（京）2018 – 0036，统一在恒温（23～25 ℃），通风良好、昼夜交替12 h光照的环境中饲养。本研究经南华大学附属第二医院动物伦理委员会批准同意。

川芎嗪注射液（批号20180307）（吉林四长制药公司）；阿托伐他汀（atorvastatin calcium tablets，ACT）（批号201502）（北京嘉林药业股份有限公司）；原位末端凋亡（TUNEL）检测试剂盒、4′, 6 –二脒基 – 2 – 苯基吲哚（4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（英国Abcam公司）；总RNA提取试剂（total RNA extractor，Trizol）（美国Sigma-Aldrich公司）；聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）测定试剂盒、2, 3, 5 – 氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride, TTC）染液（北京Solarbio公司）；放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液、苏木精 – 伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；肿瘤坏死因子 – α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、单核细胞趋化蛋白 – 1（monocyte chemotactic protein 1,MCP-1）酶联免疫试剂盒（南京建成生物工程研究所）；鼠抗沉默信息调节因子2相关酶1（sirtuin 1, sirt1）、p53、B淋巴细胞瘤 – 2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体（美国CST公司）；鼠抗Bax、cleaved-caspase3、β-actin（英国Abcam公司）；免疫球蛋白G（immuno-globulin G，IgG）二抗（美国R&D公司）。CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司）；CM3050S切片机（美国Buffalo Grove公司）。

随机选取90只大鼠参照文献法^[5]制备AMI模型，腹腔内注射40 mg/kg戊巴比妥钠充分麻醉大鼠，仰卧固定于操作台，于左侧第4、5肋间切开胸腔，打开心包，采用0号无菌丝线结扎左冠状动脉前降支根部，当结扎区域左心室颜色由红色变为白色时，心电图显示ST段抬高代表结扎成功。结扎完成后还纳心脏，缝合切口。另选15只大鼠作为假手术组，仅暴露冠状动脉不结扎，其余操作同模型组。造模结束后为预防感染，每只大鼠肌肉注射8万单位青霉素。造模过程中死亡15只，造模成功率为83.33 %。

将75只模型制备成功大鼠随机分为模型组、川芎嗪低、中、高剂量组（120、240、360 mg/kg^[6]）、阳性对照组（阿托伐他汀8 mg/kg），每组15只。川芎嗪组大鼠造模后24 h腹腔注射川芎嗪注射液，阿托伐他汀组腹腔注射ACT^[7]，假手术、AMI组大鼠均注射等量生理盐水，连续4周。心室功能测定结束后，采集大鼠1 mL尾静脉血，3 000 r/min离心5 min，于 – 20 ℃保留上清待测。各组随机选取6只大鼠充分麻醉，分离颈总动脉后逆行注射1 mL 3 % 伊文思蓝，处死后取心脏，于 – 80 ℃保存用于TTC染色；处死剩余9只大鼠，摘除心肌组织，一部分用4 % 多聚甲醛中固定，另一部分组织置于液氮中保存。

末次给药后，麻醉大鼠后固定于手术台，采用超声检测仪在二维模式下获取左心室长轴图像，检测并记录左心室舒张/收缩末期内径（left ventricular end diastolic dimension/systolic dimension, LVEDD/LVESD）、左室舒张期后壁厚度（left ventricular posterior wall diameter at diastole/systole，LVPWDd/LVPWDs）、左室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），连续检测3次心脏周期，计算平均值。

常规制备心肌组织石蜡切片，烘烤后脱蜡脱水，进行HE染色，封片后置于倒置显微镜下观察组织形态学变化。根据心肌纤维化情况对心肌组织损伤程度进行评定，无心肌纤维化为0分，纤维化比例 < 25 % 记为1分，比例在25 % ～50 % 记为2分，51 % ～75 % 记为3分，> 75 % 记为4分。

采用Tunel染色法，心肌组织切片脱蜡、水合后添加20 μg/mL蛋白酶K溶液孵育15 min，清洗后加入TUNEL反应液孵育1 h，荧光显微镜下观察细胞染色情况，拍照保存后利用Image-J软件定量评估心肌细胞凋亡率，细胞凋亡率（%） = 染色细胞数目/总细胞数 × 100 %。

采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR），采用Trizol法提取组织RNA，根据试剂盒逆转录为cDNA，qRT-PCR反应体系：10 μL SYBR反应液，1 μL cDNA，上下游引物各0.4 μL，补充ddH₂O至20 μL。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环。以U6为内参基因，采用2^{– ΔΔCt}法定量分析miR-34a mRNA相对表达量。

采用免疫印迹法，取适量心肌组织，用RIPA裂解液裂解后抽提总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定，蛋白变性后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离目的蛋白，电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后，用脱脂奶粉封闭2 h，添加鼠抗sirt1、p53、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3一抗（1 : 300），4 ℃条件下过夜孵育，次日清洗后添加IgG二抗（1 : 3 000），孵育1 h后清洗，采用电化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）曝光显色，用Image软件定量分析蛋白相对表达水平。

计量资料采用 $\overline x \pm s$ 进行描述，采用SPSS 21.0软件进行统计分析，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 川芎嗪对大鼠心脏功能影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 15） 组别（mg/kg） LVEDD（mm） LVESD（mm） LVPWDd（mm） LVPWDs（mm） LVEF（%） LVFS（%） 假手术组 5.88 ± 0.72 2.83 ± 0.51 1.72 ± 0.51 3.23 ± 0.46 78.53 ± 7.83 46.44 ± 3.39 模型组 11.12 ± 0.59 a 8.63 ± 0.85 a 1.63 ± 0.38 1.71 ± 0.42 a 34.52 ± 4.58 a 26.42 ± 2.15 a 川芎嗪 120 8.42 ± 0.95 ab 7.39 ± 0.74 ab 1.66 ± 0.45 2.45 ± 0.39 ab 46.44 ± 5.13 ab 34.92 ± 3.45 ab 　　　 240 7.23 ± 0.86 abc 6.34 ± 0.69 abc 1.68 ± 0.46 2.51 ± 0.46 ab 53.36 ± 6.07 abc 38.58 ± 2.65 abc 　　　 360 6.84 ± 0.63 abc 5.71 ± 0.53 abcd 1.69 ± 0.36 2.59 ± 0.53 ab 59.27 ± 4.26 abcd 41.06 ± 3.49 abcd 阳性对照组 6.76 ± 0.82 ab 5.64 ± 0.42 ab 1.70 ± 0.39 2.62 ± 0.47 ab 62.66 ± 6.26 ab 42.27 ± 3.16 ab 　　注：与假手术组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05；与低剂量川芎嗪组比较，c P < 0.05；与中剂量川芎嗪组比较，d P < 0.05。

表 1 川芎嗪对大鼠心脏功能影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 15）

与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD升高，LVPWDs、LVEF、LVFS降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，各剂量川芎嗪组、阳性对照组大鼠LVEDD、LVESD降低，LVPWDs、LVEF、LVFS升高（ P < 0.05）；呈一定剂量效应关系。

表 2

表 2 川芎嗪对大鼠血清中MCP-1、TNF-α水平影响（pg/mL， $\bar x \pm s$ ，n = 15） 组别（mg/kg） MCP-1 TNF-α 假手术组 19.43 ± 3.27 55.36 ± 8.52 模型组 42.09 ± 4.83 a 108.62 ± 12.35 a 川芎嗪 120 30.17 ± 3.13 ab 90.17 ± 7.13 ab 　　　 240 25.11 ± 4.03 abc 81.33 ± 6.81 abc 　　　 360 23.24 ± 3.21 abc 67.06 ± 5.42 abcd 阳性对照组 22.28 ± 2.29 ab 63.19 ± 6.18 ab 　　注：与假手术组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05；与低剂量川芎嗪组比较，c P < 0.05；与中剂量川芎嗪组比较，d P < 0.05。

表 2 川芎嗪对大鼠血清中MCP-1、TNF-α水平影响（pg/mL， $\bar x \pm s$ ，n = 15）

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、MCP-1水平升高（P < 0.05）；与模型组比较，各剂量川芎嗪组、阳性对照组大鼠血清中TNF-α、MCP-1水平降低（ P < 0.05）。

图 1

注：A假手术组；B模型组；C、D、E低、中、高剂量川芎嗪组；F阳性对照组。 图 1 川芎嗪对大鼠心肌组织病理形态学影响（HE，× 100）

结果显示，假手术组大鼠心肌组织结构正常，细胞形态完整，肌原纤维整齐排列（图1A）；模型组大鼠心肌细胞出现变性、破裂、坏死，纤维排列紊乱，部分出现断裂，同时伴有炎性细胞浸润（图1B）；低、中、高剂量川芎嗪组（图1C、D、E）、阳性对照组（图1F）大鼠心肌细胞破裂、坏死数量明显减少，肌原纤维排列逐渐恢复整齐，心肌损伤程度得到不同程度的缓解。假手术组、模型组、低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠病理学评分分别为（0.72 ± 0.16）、（3.66 ± 0.45）、（2.47 ± 0.56）、（2.15 ± 0.43）、（1.86 ± 0.48）及（1.79 ± 0.52）分；与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织病理学损伤评分升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠心肌组织病理学损伤评分降低，差异具有统计学意义（ P < 0.05）。

图 2

注：A假手术组；B模型组；C、D、E低、中、高剂量川芎嗪组；F阳性对照组。 图 2 川芎嗪对大鼠心肌细胞凋亡率影响（Tunel，× 100）

假手术组、模型组、低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠心机细胞凋亡率分别为（4.85 ± 0.57）%、（49.42 ± 6.39）%、（35.31 ± 3.42）%、（22.05 ± 2.63）%、（20.66 ± 2.14）% 及（13.89 ± 1.88）%；与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P < 0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠心肌细胞凋亡率降低（ P < 0.05）。

图 3

注：1假手术组；2模型组；3～5低、中、高剂量川芎嗪组；6阳性对照组。 图 3 川芎嗪对大鼠心肌组织中sirt1、p53 mRNR表达影响（gRT-PCR，× 100）

表 3

表 3 川芎嗪对大鼠心肌组织中miR-34/sirt1/p53通路表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 9） 组别（mg/kg） miR-34a sirt1 p53 假手术组 0.45 ± 0.16 0.85 ± 0.07 0.28 ± 0.04 模型组 1.27 ± 0.15 a 0.37 ± 0.06 a 1.05 ± 0.12 a 川芎嗪 120 0.93 ± 0.08 ab 0.46 ± 0.05 ab 0.93 ± 0.09 ab 　　　 240 0.75 ± 0.09 abc 0.55 ± 0.07 abc 0.64 ± 0.08 abc 　　　 360 0.62 ± 0.08 abcd 0.68 ± 0.09 abcd 0.55 ± 0.09 abcd 阳性对照组 0.60 ± 0.09 ab 0.72 ± 0.07 ab 0.32 ± 0.06 ab 　　注：与假手术组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05；与低剂量川芎嗪组比较，c P < 0.05；与中剂量川芎嗪组比较，d P < 0.05。

表 3 川芎嗪对大鼠心肌组织中miR-34/sirt1/p53通路表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 9）

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中miR-34a、p53 mRNA表达升高，sirt1mRNA表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠心肌组织中miR-34a、p53 mRNA表达降低，sirt1 mRNA表达升高，差异有统计学意义（ P < 0.05）；呈剂量依赖性。

图 4

注：1假手术组；2模型组；3～5低、中、高剂量川芎嗪组；6阳性对照组。 图 4 川芎嗪对大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3表达影响（WB，× 100）

表 4

表 4 川芎嗪对大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 9） 组别（mg/kg） Bax Bcl-2 cleaved-caspase3 假手术组 0.15 ± 0.04 1.12 ± 0.18 0.14 ± 0.03 模型组 1.54 ± 0.19 a 0.13 ± 0.03 a 1.12 ± 0.14 a 川芎嗪 120 1.17 ± 0.16 ab 0.25 ± 0.04 ab 0.89 ± 0.11 ab 　　　 240 0.78 ± 0.06 abc 0.37 ± 0.05 abc 0.73 ± 0.09 abc 　　　 360 0.47 ± 0.04 abcd 0.52 ± 0.13 abcd 0.42 ± 0.10 abcd 阳性对照组 0.22 ± 0.03 ab 0.84 ± 0.09 ab 0.31 ± 0.05 ab 　　注：与假手术组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05；与低剂量川芎嗪组比较，c P < 0.05；与中剂量川芎嗪组比较，d P < 0.05。

表 4 川芎嗪对大鼠心肌组织中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3表达影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 9）

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量川芎嗪组及阳性对照组大鼠心肌组织中Bax、cleaved-caspase3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义（ P < 0.05）；呈剂量依赖性。

研究表明AMI患者体内炎症水平较高，且炎症反应会进一步加重心肌损伤^[8]，心肌组织损伤后会降低心功能，引发心室重构^[9]。本研究结果显示，假手术组大鼠心肌组织、心肌细胞结构正常，而模型组大鼠心肌细胞出现破裂、变形、纤维断裂等，伴有大量炎性细胞浸润；与假手术组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD升高，LVPWDs、LVEF、LVFS降低。提示，大鼠心功能受损，模型复制成功。川芎嗪是从川芎中提取的有效生物碱单体成分，药理学研究发现其在降低血粘稠度、抗炎、抗氧化、抵抗心脑血管缺血损伤具有较好的作用^[10]。川芎嗪通过MEF2D/PGC-1α途径保护线粒体功能，从而发挥心脏保护作用^[11]，川芎嗪可通过下调AMI大鼠心肌酶水平，缓解心肌氧化应激损伤^[12]。本研究结果表明川芎嗪组大鼠心肌细胞破裂、坏死数量明显减少，炎性细胞浸润程度减轻；TTC染色显示心肌梗死体积显著减少，超声检测发现心脏收缩、舒张能力升高。提示，川芎嗪可能通过抑制心肌组织炎性损伤，提高心室收缩、舒张能力，发挥AMI心肌保护作用。

炎症反应是造成心肌损伤的重要原因。AMI后心肌损伤早期心肌组织中炎症因子和趋化因子含量迅速升高，进一步放大炎症反应，MCP-1为趋化因子之一，可募集炎症因子到达心肌组织炎症反应部位，从而加重心肌梗死、心室重构等心功能损伤^[13]。TNF-α作为重要的炎症因子，在心肌损伤后大量表达，心肌组织中TNF-α水平升高后可进一步造成心肌细胞凋亡、心肌肥大等^[14]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中TNF-α、MCP-1水平明显升高；川芎嗪组大鼠血清中TNF-α和MCP-1水平明显降低。提示，川芎嗪可能通过降低炎症因子和趋化因子的表达，降低心肌炎症反应，从而发挥对AMI大鼠心肌保护作用。

miR-34a在哺乳动物发育早期发挥重要作用，miR-34a表达降低会造成卵巢癌细胞凋亡率减少^[15]。研究发现小鼠心脏中miR-34a水平升高可加速心肌细胞凋亡^[16]，下调miR-34a水平有助于心力衰竭期间的心脏失代偿^[17]。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中miR-34a mRNA表达升高，川芎嗪组大鼠心肌组织miR-34a mRNA表达明显降低。提示，川芎嗪可能通过下调miR-34a缓解AMI心肌损伤。sirt1属于组蛋白去乙酰化酶，sirt1能够调控氧化应激、炎症等参与心血管疾病的发生，激活sirt1则能够延缓衰老、降低心血管疾病的发生率^[18]。sirt1为miR-34a靶标基因，下调mir-34a/sirt1信号通路对心肌细胞缺氧损伤具有保护作用^[19]，激活mir-34a/sirt1信号通路可加剧阿霉素诱导的心脏毒性^[20]。p53属于一种抑瘤基因，可调控下游mTOR等靶基因参与心血管疾病的发生，microRNA-34a通过sirt1/p53途径促进柯萨奇病毒B3诱导的心肌细胞凋亡^[21]。本研究结果表明模型组大鼠心肌组织中sirt1 mRNA表达降低、p53 mRNA表达升高，川芎嗪组大鼠心肌组织sirt1 mRNA表达升高、p53 mRNA表达降低。提示，川芎嗪可能通过下调miR-34a进而抑制sirt1/p53信号通路，缓解AMI心肌损伤。

研究证实，AMI后心肌细胞凋亡会造成左心室重构，进而引发心衰^[22]。Bcl-2、Bax为Bcl-2家族中与凋亡密切相关基因，细胞凋亡会导致Bcl-2/Bax平衡失调，造成Bcl-2表达降低，Bax表达升高，进一步激活caspase级联反应加速细胞凋亡^[23]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，川芎嗪组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低；模型组大鼠心肌组织Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，川芎嗪组大鼠心肌组织Bax、cleaved-caspase3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达增加。提示，川芎嗪可能通过下调miR-34a表达，进而抑制sirt1/p53通路降低心肌细胞凋亡，发挥心肌损伤保护作用。

综上所述，川芎嗪对AMI大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能与下调miR-34a，进而抑制sirt1/p53通路，降低心肌细胞凋亡等有关。