据世界卫生组织统计，全球每年约有330万人死于酒精滥用，约5.9 %的死亡率，与醉酒驾驶、酒后暴力、特别是酒精性肝病等因素密切相关^[1]。酒精性肝病致病机制复杂多样，酒精性肝病患者肠道屏障功能受损，内毒素泄漏触发脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） – Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4） – 白细胞分化抗原（cluster of differentiation-14，CD14）炎症信号通路，促进炎性因子表达，最终导致肝细胞损伤 ^{[2 – 3]}。红曲，是粳米经红曲霉发酵制成的紫红色米曲，含他汀类成分；纳豆，是大豆经枯草芽孢杆菌发酵而成的黏性豆制品。研究表明红曲和纳豆均具有改善酒精性肝损伤（alcoholic liver disease，ALD）作用^{[4 – 5]}。他汀类药物能抑制内毒素介导的TLR4信号转导和细胞因子表达^[6]。纳豆中的枯草芽孢杆菌被认为是一种益生菌^[7]，枯草芽孢杆菌摄入能上调紧密连接蛋白（claudin-1、occludin、ZO-1）表达，下调肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等细胞因子表达，改善肠道屏障功能，减少肠上皮损伤^[8]。本研究以酒精性肝损伤大鼠为研究对象，探讨纳豆联合红曲对酒精性肝损伤大鼠的改善作用及机制，旨在为纳豆红曲作为保肝保健食品的开发提供依据。结果报告如下。

SPF级雌性Wistar大鼠48只，8周龄，体重180～220 g，购自山东鲁抗医药股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20140007。饲喂普通饲料，自由饮水。

纳豆红曲粉，含纳豆激酶595.59 FU/g，含洛伐他汀4.46 mg/g，由汤臣倍健股份有限公司提供；甘利欣（甘草酸二胺胶囊）（江苏正大天晴药业股份有限公司）；56°红星二锅头（北京红星股份有限公司）；兔抗CD14、TLR4多克隆抗体、鼠抗TNF-α 单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉优尔生商贸有限公司）。半自动组织包埋机（英国SHANDON公司）；LKB-5超薄切片机（瑞典LKB公司）；JEM1200EX透射电镜（日本JEOL公司）；600型全自动生化分析仪（日本日立公司）；Tanon1600全自动数码凝胶成像系统（上海天能公司）。

大鼠适应性喂养1周，按体重随机分为4组，每组12只。对照组给予生理盐水灌胃；模型组给予56°红星二锅头灌胃，6 mL/kg 1周 + 8 mL/kg 1周 + 10 mL/kg 1周 + 11 mL/kg 7周；纳豆红曲组给予纳豆红曲粉（含595.59 FU/kg纳豆激酶，4.46 mg/kg洛伐他汀）灌胃，1 h后给予酒精；甘利欣组（阳性对照）给予200 mg/kg甘利欣灌胃，1 h后给予酒精；纳豆红曲组与甘利欣组酒精剂量同模型组，连续10周。末次灌胃后禁食不禁水12 h，称重后给予3 %戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清用于生化指标检测，留取肝和小肠组织，固定部分肝脏和小肠用于组织病理学观察和超微结构观察，其余组织 – 80 ℃保存待测。

取肝组织样品（1.0 cm × 1.0 cm × 0.5 cm）和小肠组织样品（1.0 cm × 1.0 cm × 0.2 cm），用10 %中性甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木素 – 伊红（HE）染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察各组大鼠肝脏和小肠壁形态学改变。

取肝脏和小肠组织样品（l mm × l mm × l mm），3 %戊二醛固定4 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）漂洗3次；l %饿酸固定l h，PBS漂洗3次；丙酮逐级脱水，环氧树脂（EPON8l2）包埋，温箱固化，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察大鼠肝与小肠细胞超微结构。

采用全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。

标准孔、待测样品孔、空白孔分别加入标准品、待测样品、标准品稀释液各50 μL，加入检测溶液50 μL混匀，37 ℃温育1 h；弃去孔内液体，用350 μL洗涤液重复洗涤3次；每孔加入检测溶液100 μL，37 ℃温育30 min；再重复洗板5次，加入底物溶液90 μL，37 ℃避光显色10～20 min；加入终止溶液50 μL；用酶标仪在450 nm波长测量各孔吸光度（A）值。

采用Western blot法，取肝组织，加入裂解液后匀浆，4 ℃、12 000 g离心后取上清，采用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白浓度检测法（bicinchoninic acid assay，BCA）测定样品蛋白浓度，以20 μg蛋白/泳道上样，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，电转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、检测。最后用全自动数码凝胶成像Tanon1600对胶片进行扫描，用Tanon Gis软件分析，以目的蛋白与内参蛋白的光密度比值作为目的蛋白的相对表达量。

采用SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析，方差齐的计量资料以 $\bar x$ ± s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法检验。检验水准为 α = 0.05。

图 1

图 1 纳豆联合红曲对大鼠肝组织结构影响（HE，× 400）

结果显示，对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，胞浆充盈，无变性、坏死等形态学改变（图1A）；模型组大鼠肝小叶结构模糊，细胞排列紊乱，胞浆皱缩，可见大小不等、形状不一的弥漫性胞浆空泡，并伴有脂肪变性，汇管区可见大量炎性细胞浸润（图1B）；纳豆红曲组大鼠肝细胞损伤程度明显减轻，肝索排列较为整齐，局部有少量空泡，散在可见炎性细胞浸润（图1C）；甘利欣组大鼠肝小叶结构清晰，肝窦无扩张，肝细胞无明显变性，坏死等形态学改变，无胞浆空泡，汇管区有少量炎细胞浸润（图1D）。

图 2

注：A对照组；B模型组；C纳豆红曲组；D甘利欣组。 图 2 纳豆联合红曲对大鼠小肠组织结构影响（HE，× 200）

结果显示，对照组大鼠小肠绒毛排列整齐，无缺损，黏膜下腺体大小一致且无增生，无炎性细胞浸润（图2A）；模型组大鼠小肠绒毛破损脱落，排列紊乱，黏膜下腺体萎缩，伴有炎性细胞浸润（图2B）；纳豆红曲组大鼠小肠绒毛排列相对整齐，破损脱落现象明显改善，黏膜下腺体有少量增生，排列较规则（图2C）；甘利欣组大鼠小肠绒毛排列整齐，有微量破损，黏膜下腺体较规则，无明显炎细胞浸润和增生现象（图2D）。

图 3

图 3 纳豆联合红曲对大鼠肝组织超微结构影响（电镜，× 5 000）

结果显示，对照组大鼠肝细胞核呈圆形或椭圆形，核膜完整清晰，线粒体形态正常，粗面内质网排列整齐，核糖体丰富（图3A）；模型组大鼠肝细胞核出现皱缩变形，核膜凹陷，线粒体数量减少，并出现肿胀、破裂等改变，粗面内质网扩张断裂，排列紊乱无序，核糖体脱落稀疏（图3B）；纳豆红曲组大鼠肝细胞核明显恢复，线粒体肿胀程度明显减轻，粗面内质网断裂与排列紊乱程度显著改善，核糖体数量增加（图3C）；甘利欣组大鼠肝细胞核无形态病变，线粒体结构和数量明显恢复，粗面内质网排列较整齐，核糖体均匀（图3D）。

图 4

图 4 纳豆联合红曲对大鼠小肠组织超微结构影响（电镜，× 20 000）

结果显示，对照组大鼠小肠微绒毛细长丰富，排列整齐紧密，细胞链接清晰完整，结构正常（图4A）；模型组大鼠小肠微绒毛短小稀疏，部分萎缩脱落，紧密连接肿胀，桥粒数量明显减少（图4B）；纳豆红曲组大鼠小肠绒毛损伤状况得到明显改善，微绒毛排列相对整齐，长短不一，无萎缩脱落现象，紧密连接肿胀减轻，桥粒数量相对增多（图4C）；甘利欣组大鼠小肠微绒毛排列整齐，相对变长，细胞链接无明显肿胀，桥粒数量明显恢复（图4D）。

表 1

表 1 纳豆红曲对大鼠血清酶活性影响（U/L， $\bar x$ ± s，n = 12） 组别 ALT AST GGT ALP 对照组 50.00 ± 6.940 121.10 ± 15.13 2.22 ± 1.56 125.27 ± 19.18 模型组 60.50 ± 15.40 a 152.00 ± 33.11a 4.18 ± 0.75 a 157.30 ± 46.64 a 纳豆红曲组 53.83 ± 14.68 130.16 ± 27.66 b 3.00 ± 1.09 b 137.00 ± 24.77 b 甘利欣组 57.12 ± 24.57 128.57 ± 37.97 b 3.50 ± 1.41 b 144.14 ± 25.10 b 　　注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05。

表 1 纳豆红曲对大鼠血清酶活性影响（U/L， $\bar x$ ± s，n = 12）

与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP水平明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，纳豆红曲和甘利欣组大鼠血清AST、GGT、ALP水平明显下降（ P < 0.05）。

结果显示，对照组、模型组、纳豆红曲组和甘利欣组大鼠血清内毒素水平分别为（0.369 ± 0.013）、（0.409 ± 0.021）、（0.389 ± 0.015）、（0.381 ± 0.013）ng/mL。与对照组比较，模型组大鼠血清内毒素水平明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，纳豆红曲组和甘利欣组大鼠血清中内毒素水平明显下降（ P < 0.05）。

图 5

图 5 纳豆红曲对大鼠肝组织炎症因子表达影响

表 2

表 2 纳豆红曲对大鼠肝组织炎症因子表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 3） 组别 CD14 TLR4 TNF-α 对照组 0.416 ± 0.328 0.618 ± 0.089 0.710 ± 0.127 模型组 2.209 ± 0.636 a 1.926 ± 0.425 a 1.657 ± 0.313 a 纳豆红曲组 1.550 ± 0.596 b 1.369 ± 0.276 b 1.080 ± 0.173 b 甘利欣组 1.484 ± 0.577 b 1.247 ± 0.268 b 1.020 ± 0.151 b 　　注：与对照比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05。

表 2 纳豆红曲对大鼠肝组织炎症因子表达影响（ $\bar x$ ± s，n = 3）

结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肝组织CD14、TLR4和TNF-α 蛋白表达明显升高（P < 0.05）；与模型组比较，纳豆红曲和甘利欣组大鼠肝组织CD14、TLR4和TNF-α 蛋白表达均明显下降（ P < 0.05）。

肝脏是体内主要代谢器官，长期嗜酒可导致肝损伤。研究表明，慢性酒精暴露导致持续的肠源性内毒素释放入血，介导脂多糖受体TLR-4和CD14活化，增强其敏感性，随后释放细胞因子，诱导肝细胞损伤^{[9 – 10]}。纳豆是传统发酵产品，其中含有纳豆激酶、纳豆皂苷，纳豆异黄酮等活性物质^[11]，具有溶栓降脂^[12]，提高胰岛素敏感性，改善氧化应激^[13]等作用，纳豆中的纳豆激酶是枯草芽孢杆菌在发酵过程的代谢产物。红曲中含有他汀类、甾醇、生物碱、黄酮等多种生物活性物质，具有降血脂^[14]，抗炎抗氧化^[15]，抗肿瘤^[16]，调节免疫功能^[17]等作用。研究显示，纳豆中的枯草芽孢杆菌具有解酒的功效^[18]。本研究通过酒精灌胃方法建立大鼠酒精性肝损伤模型，肝脏组织病理学和超微结构观察表明，酒精摄入引起大鼠肝脏明显的形态结构损伤，大鼠肝脏功能异常（血清中ALT、AST、GGT、ALP水平明显升高）；纳豆红曲干预能显著改善大鼠肝组织结构损伤程度，大鼠肝脏功能异常得到一定程度的恢复（血清AST、GGT、ALP水平明显下降）。

紧密连接是肠粘膜屏障形成的主要成分，通过封闭相邻上皮细胞间的间隙构成肠道屏障^[19]。肠道屏障的破坏是ALD内毒素血症的主要原因，肠道泄漏导致血液中的内毒素浓度增加^[20]。CD14和TLR4是内毒素所致炎症反应发生的起点，在炎症级联反应中具有类似于阀门作用^[21]。研究表明，长期慢性酒精摄入导致肠道屏障功能受损，内毒素由肠道渗透入血，经门静脉循环进入肝脏^[22]。一旦到达肝脏，会刺激肝细胞表面跨膜受体TLR4^[23]，CDl4是通过糖基磷脂酰肌醇（GH）锚固在巨噬细胞膜上，缺乏跨膜结构，两者起协同作用形成CD14-TLR4受体组合，将脂多糖信号转导到细胞内，介导单核巨噬细胞系统激活，核因子kB（nuclear factor kappa B，NF-kB）活化，增强肿瘤坏死因子 α（TNF-α）等下游炎症因子表达，从而导致机体肝脏损伤^{[2, 24 – 25]}。研究表明红曲霉菌提取物具有清除自由基，抑制肝微粒体脂质过氧化作用，对氨基半乳糖或半乳糖胺加LPS诱导的肝损伤具有保护作用^[26]。红曲能明显降低动脉粥样硬化小鼠体内TNF-α 水平，降低主动脉NF-κB蛋白表达，通过炎症信号通路改善小鼠动脉粥样硬化^{[14, 27]}。本研究结果显示，酒精暴露引起大鼠肠道组织结构受损，血清内毒素水平升高，肝脏TLR4、CD14、TNF-α 表达上调，与相关文献报道一致^[28]；纳豆红曲干预能显著改善酒精引起的肠道屏障组织结构损伤，抑制血清内毒素、TLR4、CD14、TNF-α 表达上调。

综上所述，长期一定量酒精摄入会引起大鼠肝脏损伤，而补充纳豆红曲在一定程度上可保护酒精性肝损伤，其机制可能与保护大鼠肠道屏障，抑制内毒素释放，降低TLR4和CD14受体表达，减少下游TNF-α 的释放有关。