鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，简称鼠疫菌）引起的一种以发病急、传播快、病死率高、传染性强为特征的烈性自然疫源性疾病，在人类发展史上，鼠疫至少造成了2亿人死亡，中世纪，鼠疫的一次大范围流行曾使欧洲人口在3年内减少了1/3。鼠疫在“销声匿迹”一个时期后，近年来在亚洲和非洲一些国家又开始小范围复发。马达加斯加自2017年8月份以来爆发鼠疫疫情，其全国114个地区中，58个（50.9 %）地区报告有肺鼠疫疫情，截止2017年12月20日，马达加斯加共报告2575例鼠疫病例，221例死亡病例（病死率9 %）^[1]。目前，尚没有有效的疫苗来预防这种疾病，对付它的唯一办法是使用抗生素。在鼠疫病人临床症状出现的早期抗生素治疗可有效防止大量的死亡，鼠疫菌对链霉素（streptomycin）、四环素（tetracycline）、氯霉素（chloramphenico）、磺胺嘧啶（sulfanilamidopyrimidine）、庆大霉素（gentamicin）、强力霉素（deoxytetracycline）、喹诺酮类（quinolones）抗生素均很敏感，目前，氨基甙类抗生素链霉素是世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐治疗鼠疫最有效的药物，特别是对肺鼠疫（pneumonic plague）^[2]。2012年4月，美国食品及药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）推荐左氧氟沙星（levofloxacin）作为人体鼠疫治疗和预防药物^[3]，为人类鼠疫的治疗增加了新的药物成员。但随着抗生素的普及，人类却又走到了事情的另一个极端：滥用或不规范使用抗生素导致耐药菌的出现及广泛传播。

按照定义，抗菌素耐药性（antibiotic resistance，简称耐药），又称抗药性，系指细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物发生改变，使原有针对性的治疗药物变得无效。致病菌产生耐药性之后，抗生素在体内无法识别病菌或对其发起攻击。早期鼠疫菌的耐药性主要表现在对某类药物的耐药，例如20世纪30年代末磺胺药上市，40年代临床广泛使用磺胺药，那时链霉素尚未广泛应用，磺胺制剂是治疗和预防鼠疫病人有效的药物，60年代谢奉璋等^[4]发现我国鼠疫菌对磺胺类药物具有一定的耐药性。近年来发现，鼠疫菌对磺胺类药物易产生抗药性，尤其在用量或疗程不足时更易出现其产生抗药性的机制，可能是磺胺类药物耐受鼠疫菌通过抑制代谢途径，其生长代谢不需要对氨基苯（甲）酸—1个叶酸和核酸合成的重要前体，它能产生较多二氢叶酸合成酶，或能直接利用环境中的叶酸，从而出现耐药性^[5]。

40年代采用链霉素进行鼠疫的临床治疗以后，也陆续出现了耐链霉素菌株。1984年武文莲等^[6]先后通过人工连续增量超过13代的方法，在实验条件下获得了3株对链霉素具耐药性的强毒鼠疫菌突变菌株，耐链霉素突变型和原鼠疫株之间在染色体特性、菌落形态上没有明显差异，对部分糖醇类酵解稍缓慢但仍保持与原株相似的生化状态，毒力减低10倍但毒力因子均为阳性，其免疫原性和免疫活性和原株基本一致。1982年，晏慧芳^[7]将60、70年代从青海省不同鼠疫疫源地和宿主分离到的313株鼠疫菌在pH7.0的肉汤中经过耐链霉素实验筛选出27株对链霉素有耐药性的鼠疫菌株，耐链霉素鼠疫菌分布比较广泛，在不同时间、不同地区、不同宿主中都存在。不论在染疫的啮齿类动物或是喜马拉雅旱獭体内和其体外寄生的跳蚤体内，还是鼠疫患者及鼠疫尸体内，分离出的鼠疫菌均有耐链霉素菌株的存在，提示人们在发生人间鼠疫疫情时，以链霉素为首选药物的前提下，必须考虑在pH7.0的的条件下耐链霉素菌株存在的问题，检测此种耐药菌株对哪种药物敏感性高，以配合链霉素的应用，提高它的疗效，弥补它的不足是有必要的。耐链霉素菌株不仅在人工连续培养、pH7.0等的实验条件下存在，而且还在自然界中也存在。1995年法国巴斯德研究所科学家Galimand等^[8]在马达加斯加分离了1株耐链霉素鼠疫菌NO.16/95，随后的研究证实，对链霉素具有强耐受性的鼠疫菌NO.16/95中存在着质粒PIP1203，该质粒长40 kb，可在鼠疫菌、假结核耶尔森菌中高频传递，在鼠疫菌、大肠菌中以较低的频率传递，其质粒上携带有氨基糖甙类酰基转移酶基因，能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化，导致了耐药性的出现^[9]。如卡那霉素激酶（编号：EC 2.7.1.95）催化三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，简称ATP）的γ磷酸转移至卡那霉素3′ – 羟基，产生3′ – 磷酸卡那霉素，也可作用于庆大霉素、新霉素等氨基糖苷抗生素，从而抑制其与核糖体结合失去抗菌活力。

80年代以后鼠疫菌耐药性逐步升级，发现了非常难治的多重耐药鼠疫菌和多重耐药鼠疫菌感染。1989年国外学者在实验条件下获得耐链霉素的鼠疫菌株，同时也发现了鼠疫菌的多耐药突变体，即同一鼠疫菌株既对链霉素具耐药性，也耐巴龙霉素（farmiglucin）^[9]。1995年，法国巴斯德研究所科学家在马达加斯加从1名高热、腹股沟淋巴结肿痛的16岁男青年淋巴穿刺液中分离了1株鼠疫菌NO.17/95，此鼠疫菌株具有多重耐药性，对氨苄青霉素（ampicillin）、氯霉素（chloramphenicol）、卡那霉素（kanamycin）、链霉素（streptomycin）、壮观霉素（spectinomycin）、磺胺类（sulfonamides）、四环素（tetracycline）、米诺四环素（minocycline）等抗菌素表现出高抗性^[10]，这是科学界迄今在人体内发现的唯一1类对多种抗生素具有耐药性的鼠疫菌。此高度耐药的多重耐药阳性鼠疫菌除个别抗生素外几乎对所有抗菌药物都耐药，对临床形成了很大的威胁，引起全球的震惊和高度的重视。

自从发现鼠疫菌耐药现象后，鼠疫耐药性引起人们的广泛关注，中外的学者们致力于对鼠疫菌抗菌药物及耐药情况的研究。1995年Smith等^[11]对1985 — 1993年在越南分离的78株鼠疫菌进行了14种抗生素的敏感性检测，发现这些菌株对链霉素、四环素、氯霉素等传统治疗药物的敏感性降低了。2000年Wong等^[12]对美国伯克利微生物实验室1977 — 1998年间收集的92株鼠疫菌进行12种抗生素的检测，发现这些菌株对链霉素、强力霉素、氯霉素等常规推荐用药敏感，但近1/5的测试菌株对亚胺培南耐药，其中15株对利福平耐药。2003年Frean等^[13]对在1982 — 1991年南非分离的100株鼠疫菌进行抗生素敏感性检测，未发现对链霉素、四环素、氯霉素等的耐药株出现。此外，还对1964 — 1988年在法国收集的94株鼠疫菌进行了24种抗菌药物的敏感性检测，发现不同地区分离的菌株耐药性没有明显差别，这些菌株均对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖甙类和强力霉素敏感，最有效的药物是氟喹诺酮类、三代头孢菌素类和氨基糖甙类，另外有30株菌对多粘霉素敏感^[14]。在我国链霉素为治疗鼠疫患者的首选特效药物，为此2003年戴瑞霞等^[15]对20世纪80年代以来分离自全国各鼠疫疫源地不同宿主的889株鼠疫菌，应用链霉素纸片以美国NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory，临床实验室标准化委员会）药敏试验纸片扩散法法规判定标准进行了链霉素耐药性监测，结果鼠疫菌对链霉素100 %高度敏感，未发现耐链霉素菌株。2007年梁云^[16]选取自1954 — 2002年间分离自各鼠疫疫源县的不同宿主的106株鼠疫菌，采用纸片琼脂扩散法（K-B法）进行了42种抗生素耐药性的监测，发现链霉素、四环素等的敏感性降低，但未发现耐药鼠疫菌株。同时国内学者也对我国不同疫源地鼠疫菌的抗生素敏感性进行了大量研究，张贵^[17]用分离自喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地的菌株对43种抗生素的敏感性进行检测，表明对鼠疫菌最敏感的抗菌药物为喹诺酮类（代表药物为诺氟沙星，norfloxacin）及头孢类药物（代表药物为头孢噻吩，cefalotin），而并不是传统中使用的链霉素，说明鼠疫菌对传统治疗药物的敏感性下降，洪梅^[18]对分离自不同年代、不同地区、不同宿主和媒介的22株鼠疫菌测定18种抗生素的敏感性，对分离自各类寄主的菌株的抑菌环均值，链霉素都是处于体外对鼠疫菌抗菌活性较高的18种抗菌药物的末位，这18种抗菌素对分离自鼠、蚤和患者的菌株的抑菌效能无显著性差异。喹诺酮类以环丙沙星敏感性优于氧氟沙星和诺氟沙星。以上研究表明，喹诺酮类抗菌素在我国鼠疫菌的体外敏感性试验研究中具有较好的抑菌效果，但至今没有左氧氟沙星在体外对不同疫源地鼠疫菌敏感性试验的研究报道。青海省依据祁芝珍等^[19]药敏试验筛选出对鼠疫菌最敏感的新型、高效、低毒的喹诺酮类（环丙沙星，ciprofloxacin）、头孢菌素类（头孢曲松钠，ceftriaxone sodium）抗生素进行了实验感染动物鼠疫疗效观察，并根据动物实验结果，将环丙沙星、头孢曲松钠与链霉素联合用药试应用于人间鼠疫临床治疗，通过对腺鼠疫、肺鼠疫初步治疗，取得了较为满意的效果。

至今我国没有发现鼠疫菌耐药菌株，但是鼠疫菌耐药株的监测仍是一项经常性的工作，在治疗鼠疫患者时药物链霉素的剂量要适当，既要避免过大剂量的应用造成药物毒性反应出现，又要注意剂量不足造成耐药性的产生；还有对FDA新的治疗鼠疫菌准入药物左氧氟沙星的敏感性研究，确定左氧氟沙星可用于我国人体鼠疫治疗的可行性。但随之而来的细菌耐药性问题也同样困扰着鼠疫防治人员，要继续明确我国野生鼠疫菌株对系列抗菌素的敏感性和耐药现状。

一项世界规模的宏基因组研究显示含耐药基因的微生物在自然界中无处不在，这意味着天然耐药性是产生耐药菌的主要原因。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。研究表明：基因突变是产生耐药细菌的根本原因，细菌通过基因突变，改变自身结构，来削弱抗生素的作用效果，从而产生耐药性。具体比如：合成药物失活酶，引起药物失活；激活药物外排泵，减少药物吸收；通过对细胞壁加强修饰，抑制药物摄取；修饰药物靶标，使得药物无法结合发挥药效。目前，对鼠疫特效药链霉素耐药是因为大多数对氨基甙类抗生素耐药的革兰阴性杆菌能产生质粒介导的钝化酶，钝化酶又称合成酶，可催化某些基团结合到抗生素的OH基或NH₂基上，使抗生素失活。例如位于胞浆膜外间隙的乙酰转移酶和磷酸转移酶及核苷转移酶分别作用链霉素NH₂基、OH基上，使氨基甙类被上述酶钝化，不易与细菌体内的核蛋白体结合，从而引起耐药性。2006年赵海红^[20]选择能作用于氨基糖的特定羟基的磷酸转移酶相关基因—氨基糖苷磷酸转移酶strA和氨基糖苷磷酸转移酶strB进行PCR扩增检测链霉素耐药基因，结果：国内1943—2005年各鼠疫疫源地18个生态型、不同宿主分离的271株有代表性的鼠疫菌，均未发现有抗链霉素基因的鼠疫菌。2018年何建根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）公布的耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、shv、ctx-m基因，耐磺胺类药物sul1、sul2、sul3基因，分别设计引物对282株分离自青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌的DNA进行PCR扩增和链霉素、磺胺甲恶唑、头孢曲松钠3种药物的耐药性检测。结果：282株菌株的PCR扩增结果均为阴性，尚未发现具有链霉素、磺胺类药及β-内酰胺类抗菌药抗药基因的菌株。而且药敏试验显示，282株菌株对链霉素、磺胺甲恶唑、头孢曲松钠均高度敏感^[21]。

对法国巴斯德研究所在马达加斯加分离的NO.17/95鼠疫菌进行研究证实，导致鼠疫菌具有多重抗药性的原因是具有抗性基因，此抗性基因编码于分子量约150 kb的可转移性质粒上，这种很容易从一种细菌转移到另一种细菌^[22]。该闭合环状的DNA可从鼠疫菌NO.17/95转入大肠杆菌，再从大肠杆菌转入鼠疫菌。DNA-DNA杂交显示抗性基因与肠杆菌科共有的毒力决定质粒密切相关。2007年法国和美国科学家联合为对鼠疫菌进行更深入的研究，法国巴斯德研究所与美国研究机构合作对鼠疫抗性质粒进行了基因组测序，并与导致其他细菌出现多重耐药性的质粒进行了对比，结果发现：导致该鼠疫菌出现多重耐药性的质粒与导致沙门氏菌出现多重耐药性的质粒极其相似，而沙门氏菌耐药性产生与一种克隆表达载体—整合子密切相关^[10]。沙门氏菌通过整合子系统，在整合酶作用下可不断从周围环境捕获外来耐药基因，使其得以表达，从而让沙门氏菌具有耐药性和多重耐药性^[23]。整合子介导的细菌耐药机制，因能解释耐药基因的高效快速传播而备受研究者关注，这同时也提示鼠疫菌很可能向具有多重抗药性发展^[22]，这一发现必须引起人们的足够重视，特别是必须尽快制定新的鼠疫菌耐药研究计划。

近年来，对不同种属人体致病菌耐药机制系统研究的热点是由质粒基因MSRA介导的主动外排泵机制，即M型耐药，以及整合子介导的细菌耐药机制，后者因能解释耐药基因的高效快速传播而备受国内外研究者关注。我国从沙门菌中也检测到了第1类整合子并证实携带有整合子的菌株要比不携带整合子的菌株更容易产生多重耐药性^[24]。Leverstei-van Hall等^[25]对全球范围内整合子介导的沙门菌耐药性进行研究，从4个大陆8个国家的90株沙门菌中发现4种整合子，并且许多菌株的整合子携带有相似的基因盒，它们对沙门菌耐药基因在全球范围内克隆表达和水平转移发挥重要作用。Yu等^[26]利用PCR技术和K-B法对复旦大学儿童医院福氏志贺菌中I类整合子流行情况及整合子与细菌耐药性的关系进行研究发现，5l株福氏志贺菌中，46株（90.2 %）携带intI基因，22株（43.1 %）携带有I类整合子，携带intI基因的46株福氏志贺菌中22株显示检测多药耐药革兰阴性杆菌qacE基因阳性，携带I类整合子的菌株对氨苄西林和氯霉素耐药率远高于未携带I类整合子的菌株；当然I类整合子还携带其他耐药基因，在其他不相关的菌株中也发现有相同的基因盒，甚至建议把I类整合子的存在作为鲍曼不动杆菌是否耐药的标志，说明耐药基因在整合子作用下可发生水平转移。

同时也发现，革兰阴性杆菌对广谱头孢菌素以及单环β – 内酰胺类抗生素产生耐药的最主要机制之一是产生 β – 内酰胺酶，由于这类酶能水解的抗生素比广谱 β – 内酰胺酶的种类多、范围广，故称之为超广谱 β – 内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）。随着β – 内酰胺类抗生素的大量应用，细菌产生的酶也越来越复杂，迄今为止已有近200种 ^[27]，其中质粒介导的超广谱β – 内酰胺酶现已发现百余种。又因为ESBLs的耐药谱宽、耐药程度高、传播速度快、范围广，几乎遍布世界各地，已引起人们的高度重视。自1983年在德国报道了首例SHV型ESBL以来臭鼻克雷伯菌，SHV型超广谱 β – 内酰胺酶逐渐增多，在部分地区已经成为革兰阴性杆菌中检出率最高的型别 ^[28]。随后在世界各地相继报道。随着产ESBLs菌株的不断出现以及相关研究的不断深入，ESBLs基因型种类越来越多。根据基因同源性的不同可将ESBLs分为：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型5大类。我国学者近年来开展了细菌耐药机制的广泛研究，刘军等^[29]对阴沟肠杆菌的研究表明，I类整合子阳性株和产ESBLs株更容易产生耐药，同时在质粒和染色体上携带I类整合子的现象常见，I类整合子与ESBLs在阴沟肠杆菌产生耐药过程中起到一定的作用。

鼠疫耐药菌株甚至多重耐药鼠疫菌株的出现，虽然尚未发现对链霉素等传统治疗药物具有较强耐受性的鼠疫菌，但监测发现存在着对传统治疗药物敏感性下降的现象，使鼠疫传统治疗方案面临挑战，因此，借鉴其他细菌的研究手段开展鼠疫菌不同耐药基因的研究，为我国鼠疫菌耐药机制提供理论依据显得越发重要。本课题组拟对鼠疫代表菌株采用双纸片协同试验筛选产ESBLs阳性菌株，检测阳性菌株中ESBLs基因的CTX-M型、TEM型、SHV型的分布，同时采用PCR和基因测序筛选源自不同疫源地的鼠疫菌耐药整合子I、II、III基因的分布明确鼠疫菌产ESBLs与携带耐药整合子基因的相关性，对I类整合子阳性菌株用5 CS和3 CS特异性引物扩增其可变区的耐药基因盒，分析鼠疫菌中I类整合子携带耐药基因合的种类。通过以上实验阐明我国鼠疫菌流行病学特征及可能存在的耐药机制，及早发现耐药菌株，对鼠疫的临床治疗和预防耐药株传播具有重要意义。