2019, Vol. 35
2. 北京农学院食品科学与工程学院;
3. 西北农林科技大学食品科学与工程学院
金黄色葡萄球菌（金葡菌）及其分泌的葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin，SE）可导致人类发生食物中毒[1]。耐药金葡菌，尤其多重耐药（multi-drug resistant, MDR）金葡菌在食源性疾病和食品中被发现，给人类健康和临床治疗带来巨大挑战[2 – 3]。本研究针对2017年中国食品中分离的397株金葡菌分离株进行抗生素药物敏感性测定，并同时进行肠毒素基因的检测，分析2017年中国食源性金葡菌的耐药性和肠毒素基因分布特征，为减少和控制金葡菌食品污染和所致食物中毒提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 菌株来源本研究所用397株金葡菌分离自2017年国家食品污染物和有害因素风险监测网采集的29个省市的食品样品。所有菌株均已经生化鉴定复核确认为金葡菌，于含40 %甘油的脑心浸液肉汤冻存管中，– 80 ℃冰箱保藏。抗生素药物敏感性测试质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213为本实验室保存。
1.2 主要仪器与试剂DensiCHEK Plus比浊仪（法国，Biomerieux公司）、聚合酶链式反应（PCR）仪和水平式电泳仪（美国，Bio-Rad公司）。脑心浸液琼脂（BHA）和肠毒素产毒培养基（北京，北京陆桥技术股份有限公司）；抗生素药敏板及药敏肉汤（上海，上海星佰生物技术有限公司）；PCR MasterMix和100 bp DNA Ladder [北京，天根生化科技（北京）有限公司]；金葡菌肠毒素基因PCR引物[上海，英潍捷基（上海）贸易有限公司]；金黄色葡萄球菌肠毒素SE-A～SE-E检测试剂盒（北京，北京良润生物科技有限公司）。
1.3 方法 1.3.1 抗生素敏感性试验根据美国临床和实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的微量肉汤稀释法[4]，以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株，测定12类13种抗生素对受试菌株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。包括青霉素（penicillin，PEN）、苯唑西林（oxacillin，OXA）、头孢西丁（cefoxitin，CFX）、万古霉素（vancomycin，VAN）、达托霉素（daptomycin，DAP）、红霉素（erythromycin，ERY）、庆大霉素（gentamicin，GEN）、四环素（tetracycline，TET）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、克林霉素（clindamycin，CLI）、复方新诺明（trimethoprim-sulfamethoxazole，SXT）、氯霉素（chloramphenicol，CHL）和利奈唑胺（linezolid，LNZ）。参考CLSI相关标准对耐药折点进行判读：将无细菌生长的抗生素最低浓度定为MIC，对含甲氧苄啶或磺胺类等抗生素的结果，以细菌生长数量较生长对照孔有80 %或以上的减少定为MIC。
1.3.2 肠毒素基因检测水煮法提取待测菌株的细菌基因组DNA，采用PCR扩增法检测22种肠毒素基因，肠毒素基因引物及扩增条件参照文献[5]。PCR产物送赛默飞世尔公司测序，将测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）BLAST上进行比对确认。
1.3.3 葡萄球菌肠毒素产毒培养对5种常见肠毒素基因（sea、seb、sec、sed和see）PCR检测阳性的菌株，按照金黄色葡萄球菌肠毒素SE-A～SE-E检测试剂盒说明书分别进行5种肠毒素的产毒培养和检测。
1.4 统计分析使用SPSS 19.0对肠毒素基因检出率进行Perarson χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 金葡菌分离株对13种抗生素的耐药结果（表1）
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表 1 397株金葡菌对13种抗生素敏感性（n = 397） |
397株金葡菌中有383株（96.5 %）为耐药株，对受试的13种抗生素呈现不同程度的耐药，其中对PEN的耐药率最高，为94.7 %（376/397），其次为ERY、TET和CLI，耐药率分别为43.3 %（172/397）、23.7 %（94/397）和20.2 %（80/397），对OXA、CFX和CHL的耐药率在10.1 %～11.1 %之间，对CIP、GEN、LNZ和SXT的耐药率均在10.0 %以下，对CIP的中介率为10.6 %（42/397），所有菌株对VAN和DAP均敏感。
2.2 耐药谱分布情况（表2）|
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表 2 金黄色葡萄球菌主要耐药谱分布情况 |
多重耐药（MDR）菌株共有120株，占所有菌株的30.2 %（120/397）。单重和双重耐药的菌株数量最多，分别占39.8 %（158/397）和26.7 %（106/397），其次为同时耐受3类和4类抗生素的菌株，均为9.6 %（38/397），同时耐受抗生素种类最多为8类。383株耐药金葡菌共计获得72个耐药谱，其中以PEN（94株）为优势耐药谱，多重耐药金葡菌中以PEN-ERY-TET（16株）、和PEN-ERY-CLI-GEN（14株）和PEN-ERY-CLI（13株）最为常见；分别检出3株和2株7重和8重耐药金葡菌，分别为PEN-ERY-CLI-CIP-TET-CHL-GEN和PEN-ERY-CLI-CIP-SXT-TET-CHL-GEN。
2.3 不同地区和食品来源金葡菌分离株耐药结果（表3）|
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表 3 不同地区和食品来源金葡菌分离株耐药分布情况（耐药率，%） |
本研究所用29个省、自治区和直辖市的金葡菌分离株的耐药率均在80 %以上，其中湖南省、江西省、上海市、湖北省和吉林省的耐药率均为100 %，其次为浙江省、甘肃省、北京市等的耐药率在90 %以上，广东省和重庆市的耐药率较低，也在85 %以上；湖南省、甘肃省、广东省、北京市和吉林省的金葡菌分离株多重耐药率在30 %以上，其次为浙江省、江西省和湖北省的金葡菌分离株多重耐药率在20 %～30 %，上海市和重庆市的金葡菌分离株多重耐药率较低，分别为16.7 %和6.3 %。
各类食品中金葡菌分离株的耐药率均在90 %以上，其中面包和巴氏杀菌乳来源的金葡菌分离株均为耐药株，蛋糕、米面制品和中式凉拌菜来源的金葡菌分离株耐药率分别为95.7 %（44/46）、95.6 %（87/91）和93.9 %（46/49）；米面制品和面包来源来源的金葡菌分离株多重耐药率最高，分别为37.4 %（34/91）和37.3 %（19/51），其他食品来源金葡菌分离株多重耐药率依次为巴氏杀菌乳（27.3 %，3/11）、蛋糕（26.1 %，12/46）和中式凉拌菜（24.5 %，12/49）。
2.4 肠毒素基因检测结果（表4）|
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表 4 不同食品来源金葡菌分离株肠毒素基因分布及5种肠毒素产毒培养结果（检出率，%） |
PCR结果显示，共有284株金葡菌检出20种肠毒素基因，占所有菌株的71.5 %（284/397）。米面制品和中式凉拌菜来源金葡菌分离株中检出肠毒素基因种类最多，分别有19种和18种，其次为蛋糕和面包来源金葡菌分离株，分别有16种和15种，此外，巴氏杀菌乳中检出7种肠毒素基因。5种常见肠毒基因中未检出see基因，sea、seb、sec和sed等其他4种基因共检出82株（20.7 %，82/397），其中以sea基因最为常见，检出率为14.9 %，明显高于sec（5.0 %）、seb（4.8 %）和sed（0.5 %）等基因的检出率（χ2 = 74.534，P < 0.05）；各类食品中也以 sea基因最为常见，以蛋糕和面包来源金葡菌分离株中检出率最高，分别为21.7 %和21.6 %，其次为米面制品（15.4 %）和中式凉拌菜（14.3 %），巴氏杀菌乳来源金葡菌分离株中sea检出率较低，检出率为9.1 %。此外还检出tsst-1基因6株（1.5 %）和seg基因50株（12.6 %）。类葡萄球菌肠毒素基因中，以sel-u基因最为常见，有83株（20.9 %），此外sel-n、sel-x、sel-o、sel-m、sel-p和sel-q等基因的检出率也在10 %以上，其他类葡萄球菌肠毒素基因检出率均在10 %以下，未检出sel-t基因。各类食品中均有不同程度的检出。
对sea、seb、sec和sed等基因阳性的金葡菌菌株进行产毒培养，检测结果见表4，90 %以上的菌株均能产生肠毒素，其中100.0 %的菌株均能产生SE-B（19/19）和SE-D（2/2），91.5 %（54/59）的菌株均能产生SE-A，90.0 %（18/20）的肠毒素基因阳性菌株均能产生SE-C。此外，有11株菌可同时产生2种或3种肠毒素。
2.5 肠毒素基因谱分布情况（表5）|
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表 5 金葡菌主要肠毒素基因谱分布情况 |
284株金葡菌肠毒素基因阳性菌株共获得115个肠毒素基因谱，表5列出了本研究金葡菌中主要的肠毒素基因谱，其中以单重肠毒素基因谱sel-p、sea和sel-s最为常见，分别有23、22和21株，此外本研究还发现同时携带 ≥ 2种肠毒素基因的情况，最多可同时携带13种肠毒素基因，为分离自米面制品的1株金葡菌，其肠毒素基因谱为sea-seb-sec-tsst-seg-sel-i-sel-k-sel-l-sel-m-sel-n-sel-o-sel-q-sel-u，携带10种肠毒素基因的2株金葡菌分别来自蛋糕和米面制品。
3 讨 论本研究结果显示，2017年我国食品中分离的金葡菌耐药率为96.5 %，不同地区和食品来源无明显差异，对PEN、ERY、TET和CLI的耐药率最高，均在20 %以上，这与我国15个代表性城市食源性金葡菌耐药情况基本一致[6]，提示这几类抗生素可能在我国食品生产加工环节长期使用。值得注意的是，本研究环丙沙星的耐药率为8.1 %，与我国其他地区报道相似[6]，中介率为10.6 %，低于顾其芳等[7]报道的上海市食源性金葡菌的中介率（23.6 %），但远高于张健等[8]在广州地区的报道（1.6 %），环丙沙星中介金葡菌的出现，提示存在金葡菌逐渐对这类抗生素产生耐受的趋势，环丙沙星是临床人类细菌性感染经验用药，因此，一旦人类感染这类耐药菌株，很可能造临床成治疗失败。本研究分别有44株（11.1 %）和42株（10.6 %）金葡菌对苯唑西林和头孢西丁耐药，这与赵英芳等[9]对山西地区食源性金葡菌的报道相一致（9.6 %）。苯唑西林和头孢西丁耐药金葡菌又被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），是引起院内感染的多重耐药菌，几乎对所有β – 内酰胺类抗生素耐药，以及其他非 β-内酰胺类抗生素如红霉素、环丙沙星和庆大霉素等。2017年，MRSA被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为对人类健康构成最大威胁的12种致病菌之一[10]。近年来食品中MRSA的日益增多，已引起了世界各国的广泛关注。
本研究结果还显示，食品来源金葡菌多重耐药率为30.2 %，这与我国其他地区以及美国、丹麦和英国等的报道基本一致[7,8,11 – 13]。不同地区的多重耐药现象存在一定差异，这可能与不同地区金葡菌的食品来源不同有关。各类食品来源金葡菌的多重耐药率均在30 %左右，其中米面制品来源金葡菌多重耐药率最高（37.4 %），该结果较本实验室2016年报道的我国零售食品中金葡菌的多重耐药率（46.2 %）有所降低[14]。容冬丽等[6]对我国部分地区即食食品中金葡菌耐药检测发现，有40 %的分离株同时对 ≥ 6种抗生素耐药，本研究也显示，金葡菌分离株可同时耐受6种甚至8种抗生素，说明我国食源性金葡菌耐药谱广，耐药现象不容乐观。因此，有必要提出食品生产加工过程中合理使用抗生素的有效措施，防止我国食源性金葡菌的耐药性进一步加重。
本研究采用PCR方法对397株食源性金葡菌进行了已报道的22种肠毒素基因检测，结果从284株菌（71.5 %）中检出了20种肠毒素基因，其中以米面制品（19种）和中式凉拌菜（18种）来源的金葡菌分离株中检出肠毒素基因种类最多，菌株还可同时携带多种肠毒素基因，最多可同时携带13种肠毒素基因，这与Zhang等[15]的研究基本一致。研究显示，金葡菌肠毒素中，由SE-A～SE-E引起的食物中毒占金葡菌肠毒素所致食物中毒的95 %以上[16]。李光辉等[17]对我国2003 — 2015年文献报道的86起金葡菌食物中毒事件进行统计发现，SE-A所引起的食物中毒事件最多，其次为SE-C。本研究有82株菌（20.7 %）检出了上述5种常见肠毒素基因，产毒培养结果显示90 %以上的肠毒素基因阳性菌株均能产毒，本研究5种肠毒素检出率与叶素贞等[18]的研究相似，但低于张锋[19]和顾其芳等[7]的结果。本研究结果还显示，sea基因最为常见（14.9 %），其次为sec（5.0 %），这与我国其他报道基本一致[8, 18 – 19]。
金葡菌是仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的导致我国细菌性食物中毒的主要病原菌[20]。当食物被金葡菌污染后，在25 ℃～30 ℃温度下放置5～10 h，就能产生足以引起中毒的肠毒素，温度越高产生肠毒素的时间越短，消费者摄入这类食品后很容易发生食物中毒[21]。值得注意的是，本研究金葡菌主要来源食品中，除巴氏杀菌乳外，米面制品、面包、中式凉拌菜和蛋糕等多为常温储存，一旦污染上述产毒金葡菌，很容易在其中繁殖并产生肠毒素，给我国居民食品安全带来严重威胁。
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