2019, Vol. 35
寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是一种单股正链RNA 病毒，属黄病毒科黄病毒属，主要通过蚊虫叮咬传播[1]，可引起寨卡病毒病，临床主要表现为皮疹、发热、关节疼痛、结膜炎等，极少引起患者死亡[2]。但在巴西，有研究者发现寨卡病毒感染可能与新生儿小头畸形有关[3]。截止2018年3月，全球范围内共有84个国家报道发现ZIKV感染病例，其中大部分为美洲国家[4]。2016年2月，我国确诊了首例境外输入性寨卡病毒感染病例，随后在广东、浙江、北京等地区相继出现26例输入性感染病例[5]。寨卡病毒全基因长度约为10.8 kb[6]，根据分子生物学和生物信息学差异，可为非洲型和亚洲型[7]，近年来美洲流行的为亚洲型。随着输入性病例的增加，结合我国南方地区湿热、蚊虫容易滋生等地理环境，不排除感染病例进一步增加的可能。因此，建立和完善寨卡病毒早期检测和病原分型系统显得尤为重要。本研究拟建立一种针对亚洲型寨卡病毒检测的实时荧光定量PCR技术，通过设计型特异性的探针和引物，特异性检测亚洲型寨卡病毒毒株。对亚洲型寨卡病毒病的早期诊断、疫情防控，尤其是育龄妇女有效预防新生儿小头畸形具有重要的临床意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒株与质粒亚洲型寨卡病毒毒株（Z16006株，广东省疾控中心病毒所提供）、A2型丙型肝炎病毒阳性血清所提取的RNA（南方医科大学输血医学系提供）、非洲型寨卡病毒对应片段（上海生工生物公司合成）、Ⅰ～Ⅳ型登革病毒（dengue virus, DENV）标准株（DENV-I夏威夷株、DENV-II新几内亚株、DENV-III-H87株和DENV-Ⅳ-H241株均由本实验室保存）。ZIKV、DENV通过C6/36细胞培养，反复冻融3次后，4℃ 12 000 r/min 离心10 min，取上清于– 80℃保存备用。
1.1.2 主要试剂与仪器载体克隆试剂盒pMDTM18-TVector Cloning Kit、逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Perfect Real Time)、PCR试剂盒Prime-STAR® GXL DNA_Polymerase购自大连宝生物工程（TaKaRa）公司；病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自德国QIAGEN公司；qRT-PCR 试剂盒 Bestar qPCR Master Mix (Taqman Probe)购自德国DBI Bioscience 公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。Roche LightCycler96荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司；NanoDrop 2000分光光度计购自美国赛默飞世尔科技公司；二级生物安全柜购自新加坡艺思高科技有限公司；细菌培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；MX-S 可调式混匀仪购自美国赛洛捷克公司；核酸电泳装置购自美国伯乐公司；台式高速离心机、移液器购自德国艾本德股份公司。
1.2 方法 1.2.1 引物探针设计从GenBank中下载多株具有代表性的亚洲型和非洲型寨卡病毒基因组全序列（其中包括亚洲型代表株P6 – 740株、非洲代表株MR 766株），以及黄病毒属其他病毒（Ⅰ～Ⅳ型登革病毒、丙型肝炎病毒），用bioedit软件进行比对，寻找特异性保守区域。利用实验室已有的亚洲型寨卡病毒株（Z16006株）序列作为模板，用AlleleID 7.2软件设计qPCR探针及引物，并用oligo7验证探针和引物的各项参数及特异性，Blast结果显示与其他种属的病毒无较高同源性。上游引物：5′-GGCTCAAGGTTAGAGAAG-3′；下游引物：5′-CCTCCTTTCCCTTAACAG-3′；探针：5′-FAM- AAC GGC TGG ATC ACA CTC TAA TG- BHQ1-3′，目的基因长度为75 bp，位于编码非结构蛋白基因NS1。引物和探针由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
1.2.2 亚洲型寨卡病毒阳性标准品制备（1）从寨卡病毒液中提取病毒核酸并进行反转录得到病毒的cDNA，以此为模板配置体系，进行常规PCR。所得产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为本实验所设计的目的片段大小后进行切胶纯化回收。（2）将目的基因连入pMD18-T载体中并转化DH5α 感受态细胞，于控温摇床中摇振荡培养，1 h后涂板。将涂有菌液的LB平板培养基倒置于细菌培养箱37℃培养12 h后挑取单菌落加入装有5 mL LB培养基的15 mL离心管中振荡培养，时间12 h，转速220 r/min，温度37℃。（3）取4 mL菌液提取质粒，具体操作参照Axygen公司质粒小量提取试剂盒说明书。（4）测定质粒DNA提取物的浓度以及OD260/OD280比值。（浓度为46 ng/μL，OD260/OD280 = 1.81）（5）将质粒送至上海生工生物工程有限公司进行基因测序，通过测序结果的比对确认质粒标准品制备成功。（6）阳性标准品作10倍梯度稀释，依次从3.415 × 108 copies/μL稀释到3.415 × 101 copies/μL。
1.2.3 特异性试验分别用非洲型寨卡病毒对应片段、Ⅰ～Ⅳ型登革病毒、丙型肝炎病毒作为样本进行荧光定量PCR检测，用去离子水作空白对照，3.415 × 105 copies/μL亚洲型标准品作为阳性对照，评价引物和TaqMan探针的特异性。
1.2.4 敏感试验将亚洲型寨卡病毒的标准品作10倍的梯度稀释，依次从3.415 × 102 copies/μL稀释到3.415 × 100 copies/μL作荧光定量PCR检测，并用去离子水作空白对照，3.415 × 105 copies/μL亚洲型标准品作为阳性对照，评价引物和TaqMan探针的敏感性。
1.2.5 荧光定量PCR反应（1）反应体系：DNA模板2 μL，探针（10μmol）和参比染料Rox reference DyeⅡ各0.2 μL,上、下游引物（10μmol）各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，Bestar qPCR Master Mix (Taqman Probe)10 μL，反应总体积20 μL。（2）反应条件：95℃120 s 预变性；95℃10 s变性，60℃30 s退火延伸，40个循环。
2 结 果 2.1 标准曲线的建立（图1、2）图1依次为亚洲型质粒DNA 108、107、106、105、104、103、102、101倍稀释后的荧光定量PCR的扩增曲线；图2为扩增标准曲线，其中相关系数R2 = 1，扩增效率E = 102 %，实验结果表明所制作的标准曲线在3.415 × 101至3.415 × 108（copies/μL）拷贝数之间有较好的线性关系。
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图 2 梯度稀释标准品的标准曲线 |
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注：1～8 依次为亚洲型寨卡病毒质粒 DNA 3.415 × 108→3.415 × 101（copies/μL）稀释后的扩增曲线 图 1 梯度稀释标准品的扩增曲线 |
2.2 特异性（图3）
图3为不同样本的荧光定量PCR的扩增曲线。其中3.415 × 105 copies/μL亚洲型标准品可见典型的阳性扩增曲线，其余样本（非洲型寨卡病毒对应片段、Ⅰ～Ⅳ型登革病毒、丙型肝炎病毒）扩增结果均为阴性。表明本试验所设计的亚洲型寨卡病毒探针和引物特异性良好，不受非洲型寨卡病毒、登革病毒以及丙型肝炎病毒干扰。
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图 3 不同样本的荧光定量PCR的扩增曲线 |
2.3 敏感性（图4、表1）
图4为不同梯度浓度（3.415 × 105 copies/μL作为阳性对照，以及3.415 × 102～3.415 × 100 copies/μL进行敏感性验证）的荧光定量PCR的扩增曲线。表1为不同梯度浓度的Ct值，其中3.415 × 102～3.415 × 100 copies/μL质粒均有明显扩增曲线，空白对照检测结果为无Ct值。表明最低能检测亚洲型寨卡病毒病含量为3.415 × 100 copies/μL，敏感性较高。
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图 4 低浓度质粒标准品的扩增曲线 |
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表 1 低浓度标准品的Ct值 |
3 讨 论
目前，寨卡病毒的诊断主要依靠症状和流行病史为基础（例如旅行史或居住史、是否被蚊子叮咬、是否出现发热、皮疹、关节和肌肉疼痛、结膜炎等症状[8 – 9]），实验室诊断试验包括病毒分离培养技术、核酸检测技术、免疫学检测技术等；由于分离培养技术和抗体ELISA检测技术存在耗时，灵敏度低，交叉反应[10 – 11]等缺点，不适合于临床大规模标本的应用，我国寨卡病毒感染的实验室确诊主要依靠核酸检测[2]，其中反转录-实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-QPCR）具有高特异性、高灵敏性等特点，适用于疾病的早期诊断[12]。同时更有研究指出，ZIKV非结构蛋白NS1是病毒与宿主相互作用的重要蛋白，无论是用免疫学方法还是分子生物学方法，NS1都可以作为寨卡病毒感染和鉴别诊断的标准[13]，肯定了NS1在寨卡病毒病诊断中的应用，故本研究在NS1区域设计探针和引物，用于寨卡病毒病的早期检测。
朱奇轩等[4]建立了基于SYBR Green的qPCR ZIKV检测方法，但没有在实际病毒样品的层面上验证引物的特异性，同时SYBR Green的特异性较TaqMan探针低。近日，有美国相关研究学者开发出Rheonix CARD®试剂盒，利用环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）技术[14]，能直接从蚊子体内以及人的血液、唾液和精液中检测到寨卡病毒；同时结合了高密度肽芯片，找到了ZIKV特异性IgG、IgM抗原表位，大大提高了检测结果的特异性。但此方法检测成本较高。本研究试验基于实时荧光定量PCR技术高效、快速、简易等特点，建立探针和引物，能够特异性鉴定亚洲型寨卡病毒株，该方法较染料法特异性高[15]，更有助于亚洲型寨卡病毒感染患者的早期诊断和治疗。
实验结果表明，本研究所设计的探针和引物特异性较高，不与非洲型寨卡病毒、登革病毒、丙型肝炎病毒产生交叉反应，可降低假阳性率。同时探针灵敏度较高，最低检测量可达3.415 × 100 copies/μL。通过构建标准曲线，确定Ct值与质粒浓度有良好的线性关系，可用于亚洲型寨卡病毒的绝对定量。下一步可将此分型技术应用于临床品检测，扩大样品检测范围，在临床水平验证引物和探针的有效性，真正实现应用于临床寨卡病毒分型的检测工作，为疾病预防、疫情控制和快速诊断奠定基础。
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