肺炎链球菌是一种重要的人类致病菌，主要引起细菌性肺炎、中耳炎、血流感染等疾病^[1]。近年来，随着抗生素的广泛应用和滥用，导致细菌的耐药性逐年递增，肺炎链球菌亦发生变异，耐药菌株递增，临床上用抗生素治疗的效果越来越差。中药是中国独有的天然资源，在预防和治疗感染病方面有着独特的作用和优势，尤其是在抗生素的耐药性和毒副作用愈演愈烈的今天，中药抗感染的研发有着巨大的应用前景。红花龙胆为多年生草本，2015版《中国药典》注明其多以根及全草入药，为我国传统中药也是苗药，在贵州少数民族地区具有悠久的苗医药应用历史，临床多用于肺炎、支气管炎、支气管哮喘、肺结核、淋巴结结核等疾病的治疗^{[2 – 4]}。本研究采用鼻腔滴注模拟临床肺炎链球菌感染的肺炎小鼠模型，给予模型组小鼠灌胃红花龙胆水煎剂，观察感染和给药后小鼠生活状况及血清C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、白细胞介素 – 6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素 – 8（interleukin-8，IL-8）等感染性指标水平变化，旨在探讨苗药红花龙胆对肺炎链球菌肺炎的防治作用，为进一步扩大民族医药红花龙胆的临床应用范围提供实验依据。

红花龙胆水煎剂成品（贵阳中医学院第一附属医院中药科提供），肺炎链球菌质控菌株ATCC49619和肺炎链球菌（中国典型培养物保藏中心提供），小鼠CRP和PCT ELISA试剂盒（贵州超研生物科技公司），小鼠IL-6和IL-8 ELISA试剂盒（武汉博士德生物公司）；麦氏比独仪（法国梅里埃公司），电子天平（美国双杰兄弟有限公司）。

清洁级雄性昆明小鼠30只，体重30 g左右，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK（黔）2012 – 0001，随机分为3组：对照组、模型组和红花龙胆组，每组10只。小鼠适应性饲养1周，实验室环境温度20～25 ℃，湿度（60 ± 20） %，正常明暗交替。随机分离来自临床标本经质控菌株严格鉴定的肺炎链球菌，划线接种于血平板，37 ℃过夜培养后挑取典型菌落，以无菌生理盐水调节其浊度。感染肺炎链球菌浓度的确定，用10 %水合氯醛按3 mL/kg剂量腹腔注射给药，待有明显麻醉症状后，用无菌针头鼻腔滴入配好的肺炎链球菌菌液100 μL（菌量3 × 10 ⁷ CFU/mL）制备肺炎链球菌感染肺炎小鼠模型。各组自由饮用自来水和饲料，模型组小鼠经10 % 水合氯醛麻醉后，经鼻腔滴注肺炎链球菌菌液100 μL（菌量3 × 10⁷ CFU/mL）；红花龙胆组小鼠经10 %水合氯醛麻醉后，经鼻腔滴注肺炎链球菌菌液100 μL（菌量3 × 10⁷ CFU/mL），并同时灌胃4 g/kg红花龙胆水煎剂，每8 h灌胃1次。给予菌液后，每4 h观察1次小鼠发病和死亡情况。小鼠感染后出现闭眼、呼吸急促等异常情况时，10 %水合氯醛麻醉后眼球取血法处死一批小鼠，全血置于EP管中，3 500 r/min，离心10 min，后分装血清，留取组织样本，保存于 – 80 ℃待检。

每4 h观察各组小鼠的精神状况、活动度、饮食、饮水量情况。

水合氯醛麻醉后眼球取血处死小鼠后，全血置于EP管中，3 500 r/min，离心10 min，采用酶联免疫法检测血清CRP、PCT、IL-6和IL-8水平，4 h内检测样本，具体步骤严格按照试剂说明书要求操作。

迅速取下一侧肺脏组织，经10 %多聚甲醛溶液固定3 d后，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精 – 伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE），光镜下观察肺脏组织上皮细胞和炎性组织浸润等病理形态学改变。

应用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以 $\overline x $ ± s表示，组间比较采用方差分析和t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组小鼠精神正常，饮食规律，毛色光泽；模型组小鼠在细菌感染17 h后逐渐开始发病，前期表现出躁动，出现打喷嚏等症状，随着感染时间延长，感染细菌30 h后小鼠症状明显加重，精神萎靡、活动减少、食量减退、立毛和蜷缩成团，100 h后小鼠出现呼吸加快、闭眼、脸部肿胀、背毛凌乱、立毛更加明显，此时处死10只小鼠；红花龙胆组小鼠在感染细菌24 h后有发病症状，出现打喷嚏，随着感染时间延长，小鼠出现精神萎靡，表现出立毛等，症状轻于模型组。

表 1

表 1 红花龙胆对肺炎链球菌肺炎小鼠血清CRP、PCT、IL-6和IL-8水平影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 30） 组别 CRP（μg/mL） PCT（ng/mL） IL-6（pg/mL） IL-8（pg/mL） 对照组 5.92 ± 1.49 0.36 ± 0.12 37.18 ± 11.98 15.79 ± 4.26 模型组 27.28 ± 7.44 a 8.12 ± 1.90 a 256.40 ± 76.45 a 134.71 ± 33.21 a 红花龙胆组 20.17 ± 3.91 ab 5.29 ± 1.28 ab 174.14 ± 30.60 ab 84.40 ± 14.94 ab 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01。

表 1 红花龙胆对肺炎链球菌肺炎小鼠血清CRP、PCT、IL-6和IL-8水平影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 30）

与对照组比较，模型组和红花龙胆组小鼠CRP、PCT、IL-6和IL-8水平均升高，差异均有统计学意义（均P < 0.01）；与模型组比较，红花龙胆组小鼠CRP、PCT、IL-6和IL-8水平均低于模型组，差异均有统计学意义（均 P < 0.01）。

图 1

注：A1：对照组；A2：模型组；A3：红花龙胆组。 图 1 红花龙胆对肺炎链球菌肺炎小鼠肺脏组织病理学影响（HE，× 40）

对照组小鼠气管上皮纤毛整齐排列，肺泡腔内无炎性分泌物，肺泡结构完好；模型组小鼠肺组织病理改变明显，支气管管腔狭窄，充满炎性渗出物，肺泡壁充血增厚，肺泡正常结构消失，肺泡腔内炎性细胞浸润，气管上皮纤毛脱落，部分纤毛消失；红花龙胆组小鼠肺组织与模型组比较，炎性渗出物明显减少，部分肺泡有炎性细胞分布，肺组织结构清晰，炎症明显减轻。

肺炎链球菌为革兰阳性菌，是引起多种疾病如肺炎、脑膜炎、血流感染的重要病原菌，在社区获得性肺炎病原体中，肺炎链球菌最为多见^[5]。随着抗生素的广泛应用，肺炎链球菌出现的耐药现象也日益增多，抗菌药物多药耐药肺炎链球菌已在世界范围内广泛传播，以亚洲的国家和地区最为严重^[6]。民族中药是我国宝贵的财富，且资源丰富，药用价值历史悠久，中药抗感染不仅是对西药有益的补充，而且在对耐药菌近乎无奈的时期，中药抗感染可显示出不可替代的疗效。红花龙胆为贵阳中医学院第一附属医院苗医药科常用的治疗肺炎中药汤剂成分，临床治疗疗效较好。本研究以肺炎链球菌肺炎模型小鼠为研究对象，给予感染小鼠灌胃贵州产苗药红花龙胆水煎剂，探讨红花龙胆的抗感染和抗炎作用，进一步拓宽了民族医药的药用价值。

细菌培养是感染诊断的“金标准”，但培养时间较长，且影响因素较多^[7]。因此，寻找早期且特异性高的感染性标志物对于早期诊断和及时治疗血流感染至关重要。CRP和PCT在诊断感染性疾病中得到了一定认可^{[8 – 9]}。其中，血清PCT作为一种新的细菌感染标志物，在临床中常广泛应用于感染性疾病的诊断与鉴别诊断；而CRP 是一种急性时相蛋白，其变化远早于体温、血常规白细胞计数、血沉等的改变，同时不受抗炎药、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素的影响，有助于感染性疾病的及时诊断及合理治疗^{[10 – 11]}。本研究结果显示，模型组和红花龙胆组小鼠CRP和PCT水平均高于对照组，提示肺炎链球菌感染后可导致机体CRP和PCT异常变化，有助于感染性疾病的及时诊断及合理治疗，且联合应用对临床诊断更有意义。给予红花龙胆灌胃后小鼠的CRP和PCT水平均低于模型组，提示红花龙胆可能具有抗感染和抗炎的效果。

肺炎导致患者机体产生剧烈的炎症反应，引起活化的单核 – 巨噬细胞释放炎症介质。炎症反应是感染性疾病的主要表现之一，是作为感染与炎症反应的重要指标，血清IL-6和IL-8均广泛应用于感染性疾病的诊疗及检测。Anderson等 ^[12]和Cockeran等^[13]研究发现肺炎链球菌可诱导中性粒细胞中IL-8的合成与释放。病原菌感染在早期确诊并给予有效的抗感染治疗是提高肺炎患者临床疗效的关键，本研究结果显示，肺炎链球菌感染后可导致机体IL-6和IL-8水平异常升高，但给予红花龙胆灌胃后小鼠的IL-6和IL-8水平均低于模型组，提示红花龙胆可减轻肺炎链球菌对机体的炎性反应，与红花龙胆提取物具有抗炎和止咳作用，可减少肿瘤坏死因子 – α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-6的产生结果一致 ^{[14 – 17]}。本研究还显示，红花龙胆组小鼠肺组织病理情况明显轻于模型组，这与炎性因子结果基本相符，提示红花龙胆对肺炎链球菌肺炎具有防治作用。

综上所述，肺炎链球菌可引起小鼠机体CRP、PCT、IL-6和IL-8水平明显升高，导致肺组织病理明显损伤。给予红花龙胆水煎剂灌胃可改善小鼠机体炎性因子水平，并减少肺炎链球菌对肺组织的浸润和损伤作用。