根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2008年的估计数据，全球有880万 ＜ 5岁儿童死亡，其中约47.6（33.3～52.9）万死亡源自肺炎球菌感染^[1]，侵袭性肺炎球菌疾病（invasive pneumococcal diseases，IPD）的疾病负担十分严重。

2000年，美国食品和药品管理局批准了7价肺炎球菌结合疫苗（7-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV7）上市，临床试验结果显示该疫苗可有效预防疫苗血清型所致的IPD，据此美国免疫规划专家咨询委员会推荐婴幼儿常规接种PCV7，之后许多国家推荐婴幼儿常规接种PCV7^{[2 – 3]}。通过对肺炎球菌结合疫苗（paneumococcal conjugate vaccine，PCV）预防IPD的效果进行评估后，WHO于2007年推荐所有国家和地区，尤其是肺炎球菌疾病负担高的国家和地区，将PCV纳入儿童国家免疫规划^[1]。然而，由于肺炎球菌有90多个血清型，而且在PCV7上市使用后，出现了某些非疫苗覆盖血清型肺炎球菌IPD发病增加的现象，流行病学监测结果提示，需要研发出包含更多肺炎球菌血清型的PCV新疫苗，以增加对肺炎球菌所致IPD的保护范围。考虑到肺炎球菌性疾病的人群发病水平低、IPD疾病诊断和监测难度大等因素，在针对新研发的PCV疫苗的保护效果评价时，如果能找到方便、恰当的评价指标，替代以IPD发病作为判定终点的评价方法，将会极大地提高PCV疫苗的研发效率。

因为PCV7疫苗的临床研究已经证明了该疫苗所含各血清型的保护效力，如果能够通过PCV7的临床研究数据，确定肺炎球菌各型别疫苗成分接种后最低的保护性抗体浓度，在对新的肺炎球菌疫苗进行评估和注册审批时，则可以考虑用疫苗免疫原性反应结果，即接种疫苗后产生的特异性抗体水平，作为疫苗效力评估的替代终点，来评价新的肺炎球菌疫苗是否与PCV7一样有效^[4]。为此，WHO进行了一系列咨询会议，制定血清学标准，以对新配方疫苗或含PCV的联合疫苗或其他接种程序进行评价^[5]。

在发展中国家，婴幼儿鼻咽部肺炎球菌的带菌率为27 %～85 %^[1]，是肺炎球菌的主要宿主库，而成为周围人群的感染来源。在个别的携带者中，细菌可以局部播散到临近部位，引起中耳炎、鼻窦炎或肺炎。在少见情况下，肺炎球菌可侵入血液引起菌血症和其他部位感染，如脑膜炎等，成为危害严重的侵袭性肺炎球菌疾病。

肺炎球菌表面的荚膜多糖是致病的主要因素。荚膜可防止补体C3b介导的调理细菌作用，干扰吞噬细胞的吞噬作用^[6]。间接证据和直接证据均证明，荚膜多糖抗体对肺炎球菌感染有保护作用^[7]，因此通过接种疫苗诱导的肺炎球菌荚膜多糖抗体对侵袭性肺炎球菌感染也具有保护作用。

评价肺炎球菌疫苗诱导的抗体主要有通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）定量检测IgG抗体和检测抗体的体外调理吞噬试验（opsonophagocytic assay，OPA）2种方法。OPA可以提供抗体功能活性的重要信息^[7]，但由于该方法受很多潜在因素的影响，目前尚没有稳定、普遍接受的OPA抗体滴度检测方法。此外，OPA检测的不仅有IgG抗体，还包括IgM等其他抗体。许多研究已经表明，婴幼儿完成PCV免疫后，血清型特异性IgG浓度与OPA滴度有很好的相关性。

此外，接种PCV除了可以产生抗体的体液免疫，PCV还会诱导T细胞应答，尽管免疫记忆对侵袭性细菌性疾病的长期保护的作用仍存在争议，但普遍认为这是蛋白结合疫苗与多糖疫苗比较的优势所在。

标准的疫苗保护效力的评价方法，是通过随机化分组，通过前瞻性队列随访观察比较接种疫苗组和未接种疫苗组的发病率情况来计算通过接种疫苗保护了多少比例的人发病，也是目前新疫苗开展III期临床试验提交注册审批，分析和评估疫苗保护效力的主要方法。所用公式为：疫苗效力 = 1–疫苗组发病率/对照组发病率。

但是，如果既往已经有有效的疫苗获批上市并广泛使用，在研发针对相同疾病的新疫苗时，往往很难用发病率为判定终点进行随机对照研究来证明疫苗效力。这种情况下，通常采用可预测疫苗保护效力的免疫学指标作为替代指标来评价新疫苗的效力。例如现阶段新研发的脊髓灰质炎灭活疫苗就是用接种疫苗后产生的脊灰病毒中和抗体滴度来进行评价。

用免疫学指标来评估疫苗预防疾病效力的方法，其关键要确定能够预测疫苗保护效力的抗体临界浓度，需要2个假设：其一，基础免疫后的抗体浓度可以预测保护效力；其二，疾病风险和抗体浓度之间的关系为离散性函数，而不是连续性函数。在这2个假设成立的前提下，在同一个研究人群中，对不同亚组的疾病发病率和抗体浓度进行比较。理想情况下，应在个体水平分析保护的相关因素，如接种疫苗后，长期队列随访观察相关疾病的发病情况。但也可在群体水平进行分析，例如，横断面研究比较同一人群的抗体浓度和保护效力信息^[7]。例如，通过以疾病保护为判定终点的临床试验中观察到的对疾病的疫苗效力以及在相同临床试验人群中基础免疫后疫苗组和对照组抗体浓度的反向累积分布曲线，利用下述公式，计算得出总的抗体保护浓度阈值：疫苗效力 = 1–疫苗组发病概率/对照组发病概率；疫苗效力 = 1–疫苗组抗体小于抗体保护阈值的百分比/对照组抗体小于抗体保护阈值的百分比。利用上述方法获得了相对准确的疫苗效力免疫学替代指标后，在对新疫苗的评估时，即可使用该免疫学指标替代疾病保护指标，将拟评估新疫苗和已证明有效疫苗的免疫学指标进行非劣效比较来预测新疫苗的保护效力，提高疫苗临床研究和注册的效率。

为确定PCV对IPD保护效力的免疫学相关指标，供监管机构对新型PCV制剂进行临床评价时参考，WHO于2002年5月在阿拉斯加Anchorage组织了1次咨询会议。咨询会上，对预测肺炎球菌疾病保护效力的血清学标准数据进行了审核。但在Kaiser-Permanente试验中，PCV7血清型特异性效力在7种血清型中只有4种具有统计学意义，而其余3种血清型的疫苗效力因为病例较少，其效力无统计学意义^[8]。

由于并非所有血清型都已经观察到有统计学意义的效力，效力有统计学意义的血清型置信区间也非常宽，因此尚不能确定各个疫苗血清型的特异性血清学保护标准。在此基础上，如果假设各血清型的保护性浓度相似，所有血清型采用1个相同阈值浓度，并且忽略未接种疫苗组的背景抗体浓度，根据Kaiser-Permanente试验总的疫苗效力^[2]，计算得出PCV7完成3剂次基础免疫后血清抗体的保护性阈值浓度为0.20 μg/mL^[8]。

由于WHO在2002年5月咨询会因样本量有限，尚未能得到令人满意的肺炎球菌抗体保护性阈值，因此会议建议进一步利用所有已经完成的PCV效力试验，汇总免疫原性和疫苗效力数据进行再分析，以缩窄效力估计值的置信区间，并纳入更多人群，以增加分析的代表性。进一步分析包括3个双盲随机对照试验结果：北加州试验^[2]、南非试验^[9]和美洲印第安人试验^[10]。用同样方法计算得出具有保护性的抗体浓度阈值为0.35 μg/mL^[5]。检测调理吞噬抗体滴度也支持采用这个阈值浓度：IgG在0.20～0.35 μg/mL时，其抗体浓度与1 : 8的调理吞噬抗体滴度相关性最好，而1 : 8的调理吞噬抗体滴度与保护效力相关性最好。

在此基础上，WHO推荐采用下述标准，将新疫苗与已获批上市并证明对IPD有效的疫苗对比，进行非劣效性比较分析。（1）主要终点。①三剂基础免疫后4周用ELISA法检测的血清IgG抗体浓度为最佳终点和主要的注册参数。②推荐肺炎球菌所有血清型采用同一个阈值或参考抗体浓度（0.35 μg/mL），该浓度已经通过针对IPD的3个效力试验验证，但这个阈值浓度并不一定代表针对个体有保护。③上述参考值采用无22F型预吸附的ELISA检测。采用其他方法检测抗体浓度时，需要与这种方法桥接推导出等效阈值浓度，且要用参比试验校准。④首选用已注册（已证明效力）的疫苗做参照，将待评价新疫苗与参比疫苗进行直接临床对比。⑤对应答者比例（免疫后抗体浓度高于阈值浓度者的百分比）进行对比分析，判断是否满足非劣效性。⑥对于参照疫苗中存在的血清型，新疫苗或联合疫苗接种后每个血清型的应答者百分比要与同一人群中对照疫苗的同一血清型应答者的百分比进行比较。理想情况下，注册疫苗中所含的每个血清型的抗体反应都满足非劣效标准，但这并非绝对要求。对于一个或多个血清型不满足非劣效性标准时，应该逐个分析决定。⑦对于参照疫苗中未包含的血清型，可用参比疫苗所有血清型的平均反应进行非劣效比较。如果一个或多个新血清型不能满足这一标准，可逐个考虑做出决定。（2）支持注册必须满足的其他标准。除了主要终点要满足非劣效标准外，还需要通过亚组分析来证明抗体功能以及诱导免疫记忆。考虑疫苗诱导的保护时，除考虑抗体浓度外，也要考虑抗体的质量^[11]。抗体功能通过检测三剂基础免疫后抗体的调理吞噬活性来证明，但要注意用来检测调理吞噬活性的方法应与参比方法可比。因为蛋白结合疫苗免疫可以诱导免疫记忆，因此也要考虑免疫记忆的作用^{[15 – 16]}。（3）抗体检测方法的说明。在上述标准提出后，又对ELISA方法进行了改进，即用22F型肺炎球菌多糖预吸附去除非特异性抗体，增加疫苗血清型抗体的特异性。评估发现，接种PCV7的婴儿血清在用22F吸附后，抗体浓度只有轻微下降，未接种疫苗的对照组则有显著下降。用22F型肺炎球菌多糖预吸附后，重新计算的保护浓度从0.35 μg/mL轻微下降至0.32 μg/mL，这些数据支持继续沿用WHO推荐的0.35 μg/mL作为婴儿接种PCV后预防IPD的最低保护浓度^[4]。此外需要注意的是，用来评估保护性阈值的抗体浓度依据的是接种对象完成肺炎结合疫苗基础免疫后的抗体浓度，而不是在其他时间点的浓度或其他年龄组或接种多糖疫苗后的浓度。

由于最初注册批准PCV疫苗的依据是针对IPD的保护效力，WHO制定的血清学保护标准适用于预测对IPD的效力，并用于注册新的PCV疫苗。对于较为常见的非侵袭性肺炎球菌疾病，如急性中耳炎（acute otitis media，AOM）、非菌血症性社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）以及肺炎球菌在鼻咽部定殖，在流行病学、临床、社会和经济方面的影响非常严重，评估疫苗是否可以影响这些疾病及其严重程度可能对于注册新的PCV疫苗非常重要。但目前用于预测对IPD保护效力的血清学标准，并不能预测对肺炎球菌引起的非侵袭性疾病的保护效力，目前的效力数据尚不足以得出针对这些疾病终点的具体标准。基于现有的临床试验结果，目前市场上的PCV预防肺炎球菌携带、AOM和CAP的效果要低于IPD，提示对肺炎和中耳炎等粘膜性疾病的保护需要更高水平的抗体浓度^[7]，但目前尚没有明确的数据建立CAP的血清学保护相关标准^{[12 – 13]}。此外，目前的新肺炎球菌疫苗的注册仍然需要基于IPD终点进行评估^[8]。

有间接队列研究发现，PCV13的6个新增血清型中有4个效果较为理想，不同血清型保护的血清学相关标准存在显著差异，因此用一个总的平均血清学保护标准并不精确。研究还表明，由于各血清型之间存在显著差异，对于OPA不能使用一个单一的保护标准。尽管如此，0.35 μg/mL的标准源自已经证明针对IPD效力的PCV7，目前用于效力暂未被证明的更多血清型PCV疫苗的注册。由于未来的疫苗中可能会纳入更多血清型，其效力同样没有得到证明，因此弃用目前接受的0.35 μg/mL标准并不明智。新疫苗的注册仍然需要以血清学指标的非劣效性标准为基础，与现有获批上市的PCV疫苗进行比较研究^[16]。

PCV的血清学保护标准适用于群体而不是个人。因此，如果一个人群中有高比例的个体抗体浓度高于保护阈值，可以预测该人群对IPD的保护水平也会很高。但这个阈值并不一定代表个体保护。在特定的个体，暴露于肺炎球菌后是否发病可能取决于多个宿主和病原体因素^[4]。对更常见和疾病负担更高的肺炎球菌疾病，如粘膜性疾病，还没有确定保护的任何血清学相关标准。但这些因素并不影响PCV疫苗的推广使用。全球各国家和地区在将13价肺炎球菌结合疫苗（13-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV13）纳入免疫规划后，无论是成人还是婴幼儿，均证明疫苗可有效预防肺炎球菌疾病，包括IPD、全因肺炎住院、影像学确诊肺炎、AOM和疫苗血清型定殖等^{[17 – 41]}。