众多流行病学研究资料表明，叶酸缺乏或代谢障碍可增加肿瘤发病风险^[1]。其中叶酸代谢循环的关键限速酶5, 10–亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reducase, MTHFR）和甲硫氨酸合成酶（methionine synthase，MS）与消化系统肿瘤的相关性研究较多^{[2 –3]}，常见的是MTHFR C677T和MS A2756G突变，在人群中呈多态性分布，具有种族和地域差异，这种差异可能与人群对叶酸及其代谢关键酶的易感性有关。河南林州是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区之一，林州部分居民113年前移居到山西长治地区，长治移民中98 %以上的居民是林州人后裔，但是他们的生活环境、饮食习惯已与河南林州地区发生了较大变化，而与山西长治当地情况相似，因此，这一独特人群既有着世界上食管癌发病率最高地区林州人群的遗传背景，同时又有着与长治地区本地居民相似的生活环境和饮食习惯。为了解叶酸、MTHFR C677T和MS A2756G基因多态性在山西长治移民与非移民人群中的分布特点，获得群体遗传学资料，并进一步研究其与疾病的相关性，本研究对2014年5月 —2015年6月在长治医学院附属和平医院就诊的80名长治林州移民和108名长治本地居民进行叶酸水平测定和基因多态性分析。结果报告如下。

分2个组　（1）长治林州移民组：收集2014年5月 — 2015年6月在长治医学院附属和平医院进行胃镜检查，证实无食管、贲门及胃黏膜癌变者长治林州移民80名，其中男性26名，女性54名，年龄44～77岁；（2）长治非移民组：收集同期在长治医学院附属和平医院进行胃镜检查，证实无食管、贲门及胃黏膜癌变者长治本地人群居民108名，其中男性48名，女性60名，年龄43～78岁。所有研究对象吸烟、饮酒史：确诊前从不吸烟、饮酒为阴性，否则为阳性。所有研究对象均签署书面知情同意书。采用食物频率调查问卷法（Food Frequency Questionnaire，FFQ）对所有入选研究对象进行膳食调查，调查问卷显示：2个组人群摄入的叶酸基本一致，均无含额外叶酸药物的补充。所有研究对象均空腹采集静脉血5 mL，EDTA抗凝，30 min内分离血浆，2 000 r/min离心15 min，– 80 ℃冻存。

采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法检测2个组人群血浆中叶酸水平。参照人叶酸酶联免疫分析试剂盒（美国，RD公司）说明书进行，根据标准品的浓度及对应的吸光度值（A）计算样品浓度，计算血浆中叶酸浓度水平。

（1）DNA的提取：参照Wizard基因组DNA提取试剂盒（美国，Promega公司）说明书提取全基因组DNA，– 20 ℃保存备用。（2）PCR扩增：采用聚合酶链反应 – 限制性片段长度多态性技术（polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism ，PCR-RFLP）分析MTHFRC677T和MSA2756G基因多态性。MTHFR C677T正向引物:5′-GAA GCA GCG AGC TTT GAG GC-3′，反向引物：5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′；MSA2756G正向引物：5′-TGT TCC AGA CAG TTA GAT GAA AAT C-3′；反向引物：5′-GAT CCA AAG CCT TTT ACA CTC CTC-3′。反应体系为20 μL，包括10 × EasyTaq缓冲液 2 μL，2.5 mmol dNTPs 1.6 μL，10 μmol的正反向引物各0.8 μL，DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 12.6 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃冷却保存。MTHFR C677T PCR产物为134 bp ，MS A2756G PCR产物为221 bp。采用PCR纯化试剂盒（中国，碧云天公司）对PCR产物进行纯化。（3）限制性内切酶多态性分析：MTHFR C677T用Taq^aI限制性内切酶酶切，反应体系置于65 ℃水浴过夜。MS A2756G用HaeIII限制性内切酶酶切，反应体系置于37 ℃水浴过夜。酶切产物经12 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V，70 min）检验。MTHFR C677T基因型：仅有134 bp片段的为纯合子野生型（CC型），若含有59 bp和75 bp 2条带，则为纯合子突变型（TT型）；若含有134 bp、59 bp和75 bp 3条带，则为杂合子突变（CT型）；MS A2756G基因型：仅有221 bp 1条片段的为纯合子野生型（AA型）；若含有70 bp 1个片段的为纯合子突变型（GG型）；若含有211 bp和70 bp 2个片段的为杂合子突变（AG型）。

将经过调查的资料录入计算机，建立Excel 2007数据库，采用SPSS 18.0软件进行统计分析。经正态性检验，血浆叶酸水平呈非正态分布，两样本比较采用Mann-Whitney检验，多组之间的比较采用Kruskal-Wallis检验；采用Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度检验研究样本的群体的代表性，对不同人群组间基因型及等位基因频率比较采用χ²检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

结果表明移民组与非移民组人群叶酸均值分别为36.62和36.21 μg/L，经Mann-Whitney检验，差异有统计学意义（P < 0.05）。长治移民组组内比较结果表明，不同性别、年龄和是否饮酒的人群之间叶酸水平差异有统计学意义（ P < 0.05），非移民组组内比较结果表明，不同血型的人群间差异有统计学意义（ P < 0.05）；长治移民组和非移民组组间比较结果表明，女性、> 60岁、不吸烟、不饮酒和体质指数（body mass index，BMI） < 18.5 kg/m ²的人群中叶酸水平差异有统计学意义（P < 0.05）。

表 1

表 1 2组不同临床特征人群的血浆叶酸水平比较（μg/L） 临床特征 移民组 非移民组 总人群 人数 叶酸 P值 人数 叶酸 P值 P值 总体 80 36.62 108 36.21 0.006 性别 男性 26 37.31 0.038 58 37.22 0.460 0.078 女性 54 36.29 50 35.12 0.011 年龄（岁） ≤60 30 31.10 0.001 70 39.80 0.126 0.707 > 60 50 39.94 38 29.60 0.000 吸烟 是 14 37.30 0.135 48 31.02 0.570 0.130 否 66 36.48 60 40.10 0.011 饮酒 是 8 40.88 0.025 35 31.43 0.379 0.053 否 72 36.15 73 37.87 0.003 BMI（kg/m2） < 18.5 4 35.27 0.670 32 31.60 0.118 0.027 18.5～ < 24.0 30 35.67 49 35.73 0.551 24.0～ < 28.0 30 34.93 11 28.76 0.027 ≥28.0 16 41.94 16 32.82 0.940 血型 A 20 33.23 0.226 32 33.18 0.002 0.821 B 30 36.07 28 44.50 1.000 O 24 34.88 36 30.92 0.334 AB 6 57.68 12 38.61 0.574

表 1 2组不同临床特征人群的血浆叶酸水平比较（μg/L）

MTHFR基因型的分布频率在移民组和非移民组中经Hardy-Weinberg平衡检验，符合H-W平衡（P > 0.05），样本具有人群代表性。移民组中MTHFRC677T表现出以野生型CC（83.8 %）为主，杂合型和突变型TT较低（13.7 %，2.5 %）；非移民组中MTHFRC677T野生型CC和突变型TT分布相近（38 %，39.8 %），杂合型较低（22.2 %）；2组基因型和等位基因频率比较差异有统计学意义（ P < 0.05）。

表 2

表 2 2组MTHFR基因型及等位基因的分布 人群 人数 基因型频率 等位基因频率（%） CC CT TT P值 C T P值 人数 % 人数 % 人数 % 移民组 80 67 83.8 11 13.7 2 2.5 0.00 90.6 9.4 0.00 非移民组 108 41 38.0 24 22.2 43 39.8 49.1 50.9 合计 188 108 35 45 139.7 60.3

表 2 2组MTHFR基因型及等位基因的分布

MS基因型的分布频率在移民组和非移民组中经Hardy-Weinberg平衡检验，符合H-W平衡（P > 0.05），样本具有人群代表性。移民组中MS A2756G表现出以杂合型AG（70 %）为主，突变型居中（27.1 %），野生型AA最低（2.9 %）；非移民组中MS A2756G表现出以野生型AA为主（52 %），突变型GG较低（12 %），2组基因型和等位基因频率比较差异有统计学意义（ P < 0.05）。

表 3

表 3 2组MSA2756G各基因型及等位基因的分布 人群 人数 基因型频率 P值 等位基因频率（%） AA AG GG A G P值 人数 % 人数 % 人数 % 移民组 80 2 2.9 56 70.0 22 27.1 0.00 37.5 62.5 0.00 非移民组 108 58 52.0 39 36.0 11 12.0 71.8 28.2 合计 188 60 95 33 109.3 80.7

表 3 2组MSA2756G各基因型及等位基因的分布

流行病学调查及实验表明，叶酸及其代谢的关键酶MTHFR和MS基因多态性在不同地区和种族的人群中分布存在差异，研究不同人群MTHFR和MS基因多态性有助于了解其与疾病的关系。但目前国内外关于叶酸与食管癌的关系研究报道结果不一致^{[4 – 5]}。Cai等^[6]对426名中国人群调查发现，人均血清叶酸水平为9.37 ng/mL，MTHFR C677 T杂合型CT占46.7 %，野生型CC占15.7 %，突变型TT占37.6 %。Yang等^[7]报道MTHFR基因在欧洲和北美T等位基因频率从北到南是逐渐增加的；但在印度和中国少数民族人群中T等位基因频率却是一个相反的趋势^{[8 – 9]}。谢渊等^[10]报道MS 2756 G等位基因频率在布依族、侗族、苗族中差异无统计学意义，与中国北京汉族、河南汉族、宁夏回族及欧洲人群相似，与日本人、印度人、非洲人之间差异有统计学意义。陈云霞等^[11]报道长治地区育龄女性MTHFR C677 T中CC、CT、TT基因频率分别为12 %、48 %、40 %，C、T等位基因出现的频率分别为36 %和64 %。但目前尚未见有长治林州移民与非移民的研究报道。

本研究比较了长治林州移民与非移民人群血浆叶酸含量及MTHFR C677T和MS A2756G基因多态性，结果显示，2组人群虽然后天生活环境相近，但由于人群来源不同，不同临床特征的人群血浆叶酸差异显著。移民组中MTHFR C677T表现出以野生型CC为主，杂合型和突变型TT较低，非移民组中MTHFR C677T野生型CC和突变型TT接近，杂合型较低；移民组中MS A2756G表现出以杂合型AG为主，野生型AA很低；非移民组中MS A2756G表现出以野生型AA为主，突变型GG较低，两组人群等位基因频率差异均有统计学意义，结果进一步证实了MTHFR C677 T和MS A2756G位点是一种多态性，在不同人群中的分布具有较大差异。

有研究表明，MTHFR 677 T突变和MS 2756 G突变的个体发生食管癌的危险性增加^[12]。本研究中2组人群均为健康人群，移民组中MTHFR T等位基因频率远远低于非移民组，但G等位基因频率高于非移民组，且两组人群叶酸分布不同，这种差异要求在制订相关人群健康干预方案时要因人而异，不能使用统一标准，应因地制宜制订具有针对性的卫生政策，更合理地指导人群补充叶酸，从一级预防的水平减少发病率。