肺纤维化是一种慢性进行性发展的肺间质疾病，近年来其发病率有逐年上升趋势，然而目前尚无特殊的治疗方法，且死亡率较高，现已成为严峻的健康问题。寻找安全有效的治疗肺纤维化药物迫在眉睫^{[1 – 2]}。研究表明金丝桃苷在抗炎、抗氧化等方面具有重要作用，然而国内外对于其在肺纤维化中的作用研究较少^[3]。本研究采用一次性气管滴入博莱霉素经典造模方法复制肺纤维化小鼠模型，采用金丝桃苷进行干预，以强的松为阳性对照，观察金丝桃苷对肺纤维化小鼠干预作用，并探讨其作用机制。结果报告如下。

倒置显微镜（日本Olympus公司），台式离心机（德国Eppendo公司），电子天平（德国Sartorius公司），RMZ128轮转式切片机（德国Leica公司），多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）。金丝桃苷（上海阿拉丁有限公司），注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社），强的松片（天津天药有限公司），小鼠转化生长因子–β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）试剂盒（安徽巧伊生物科技有限公司），小鼠羟脯胺酸（hydroxyproline，HYP）、白细胞介素–6（interleukin-6，IL-6）试剂盒（南京建成科技有限公司），抗胶原蛋白Ⅰ（collagenⅠ）、抗collagen Ⅲ抗体（美国CST公司）。

健康雄性C57BL/6小鼠36只，体重18～20 g，6～8周龄，由桂林医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2013–0001。在温度为20～26 ℃，湿度为40 %～70 %条件下，给与小鼠全价营养颗粒饲料常规喂养。

36只小鼠随机分为对照组（生理盐水10 mL/kg）、模型组（生理盐水10 mL/kg）、金丝桃苷高、中、低剂量组（100、50、25 mg/kg）、强的松组（6 mg/kg），每组6只；每天灌胃1次，连续28 d。

在常规喂养小鼠7 d后，采用一次性气管内滴注博来霉素方法建立肺纤维化模型。用7 %水合氯醛按照0.05 mL/10 g剂量小鼠腹腔注射麻醉，将小鼠用鼠板固定，用棉线固定其四肢及上门牙，用镊子轻轻拉出舌头，在小鼠吸气瞬间，用腰穿针插入其气管，迅速注入博来霉素溶液（5 mg/kg）。注入博来霉素后立即竖立鼠板，旋转鼠板2 min，使药液在小鼠肺内分布均匀。

小鼠于第28天给药2 h之后摘眼球取血，首先用7 %水合氯醛将小鼠麻醉，待麻醉成功后收集小鼠血液，放在冰上静止约1 h，4 ℃、3 000 r/min、离心20 min，吸取上层淡黄色血清存放于 – 80 ℃冰箱中备用。

用乙醇消毒小鼠颈部皮肤，沿颈部正中线切开皮肤至胸腔入口处，用止血钳分离出组织和肌肉，暴露气管；左手持镊子，提起气管，右手朝气管隆突方向插入针头。以1 mL注射器抽吸0.8 mL生理盐水并注入气管，30 s后将生理盐水回抽，重复灌洗3次，按1 500 r/min转速将肺泡灌洗液离心10 min，取上清液用于细胞因子检测。

将小鼠平放在鼠板上，用酒精擦拭腹部皮肤，剪开腹部，分离肺组织，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）将肺组织表面血迹洗净，将右肺中叶放在10 %福尔马林中固定，用于苏木素–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson染色；其余肺组织放入冻存管中，并放入液氮中2 h，然后转移至 – 80 ℃冰箱中保存备用。

每天观察并记录小鼠一般情况，包括小鼠皮毛变化、体重变化、呼吸情况、精神状态等。

将肺组织取出后用4 %多聚甲醛进行固定，切片、捞片、脱蜡等步骤，分别进行HE染色和Masson染色，在光学显微镜下对肺组织进行病理学观察，主要观察肺组织的损伤及肺纤维增生情况。使用Szapiel法对肺泡炎和肺纤维化程度进行积分评价^[4]。HE染色对肺泡炎程度进行评价，0分：镜检肺泡形态无异常；1分：肺泡炎症为轻度，有少许炎症细胞浸润；2分：中等程度肺泡炎症；3分：肺泡炎症为重度，呈弥漫性分布。Masson染色对肺纤维化程度进行评价，0分：肺组织正常，无胶原纤维增生；1分：少量胶原纤维；2分：胶原纤维较多，肺泡塌陷，肺泡结构紊乱；3分：大量胶原纤维，肺泡塌陷融合，肺泡结构明显破坏。

采用免疫组化法，将包埋好的小鼠肺组织石蜡切片切成4 μm厚度，脱蜡后置于3 % 双氧水中，用山羊血清封闭，滴加一抗4 ℃过夜，第2天滴加二抗，用二氨基联苯胺显色液染色，脱水、封片。在光镜下（200倍）棕黄色区域为阳性。

将肺组织取出后用沸水水解约20 min，依次按照试剂盒中说明书要求分别加入相关试剂，调节pH为6.0～6.8，最后将待测样本在60 ℃条件下水浴15 min，冷却离心之后取出上清，放入酶标仪中在550 nm处测吸光度（A）值。羟脯氨酸含量（μg/mg）=（测定A值 – 空白A值）/（标准A值 – 空白A值）× 标准含量（5 μg/mL）× 水解液总体积（10 mL）/组织湿重。

从 – 80 ℃冰箱中取出待测血清样品常温溶解，将血清稀释10倍，严格按照酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒说明书步骤依次加入相关试剂，最后用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，制作标准曲线并根据曲线计算出TGF-β1含量。

将待测肺泡灌洗液常温溶解，按照ELISA试剂盒说明书步骤依次进行温育、洗涤、加酶、显色、终止显色等操作，最后于450 nm波长处测吸光度（A）值，根据标准曲线计算IL-6的含量。

计量资料用 $\bar x \pm s $ 表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，如差异有统计学意义，用最小差异法检验进行两两比较，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

对照组小鼠在实验过程中精神状态无明显异常，体重呈持续性增长；模型组小鼠食欲下降，并出现精神萎靡、呛咳等情况；各剂量金丝桃苷组、强的松组小鼠在造模初期出现食欲下降、精神萎靡及呛咳状况，从第7天开始，上述症状逐渐减轻。对照组、模型组、金丝桃苷高、中、低剂量组、强的松组小鼠体重分别为（29.43 ± 0.92）、（23.87 ± 1.30）、（26.83 ± 0.97）、（26.57 ± 0.83）、（26.14 ± 0.99）、（25.33 ± 1.43）g。与对照组比较，模型组小鼠体重明显降低（P < 0.01）；与模型组比较，各剂量金丝桃苷组、强的松组小鼠体重均明显增加（ P < 0.05）。

对照组小鼠肺组织结构未见明显异常（图1A）；模型组小鼠肺泡间隔明显增宽，肺泡融合塌陷、结构紊乱，可见大量炎细胞和成纤维细胞（图1B）；金丝桃苷高剂量组小鼠肺泡间隔增宽程度较模型组明显改善，肺泡间隔中仍可见少量炎性细胞和成纤维细胞增生，肺泡结构也较模型组明显改善（图1C）；中剂量金丝桃苷组小鼠肺泡间隔增宽，有少量炎性细胞和成纤维细胞，肺泡结构破坏较严重（图1D）；低剂量金丝桃苷组小鼠肺泡间隔增宽明显，肺泡间隔有大量炎性细胞和成纤维细胞质增生，肺泡结构破坏严重（图1E）；强的松组小鼠肺组织肺泡间隔可见炎性细胞浸润，肺泡结构破坏有所改善（图1F）。对照组、模型组、金丝桃苷高、中、低剂量组、强的松组小鼠肺泡炎积分分别为（0.17 ± 0.41）、（2.83 ± 0.41）、（1.00 ± 1.10）、（1.67 ± 1.03）、（1.67 ± 0.82）、（1.50 ± 1.05）分；与对照组比较，模型组小鼠肺泡炎积分明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，各剂量金丝桃苷组、强的松组小鼠肺泡炎积分明显下降（ P < 0.05）。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：金丝桃苷高、中、低剂量组；F：强的松组。 图 1 金丝桃苷对小鼠肺组织炎症影响（HE，× 200）

对照组小鼠肺组织中可见少量绿色，属正常染色反应（图2A）；模型组小鼠肺组织中可见大量绿色，绿色部位为胶原纤维（图2B）；高剂量金丝桃苷组小鼠肺组织绿色较模型组明显减少（图2C）；中剂量金丝桃苷组小鼠肺组织中可见明显绿色（图2D）；低剂量金丝桃苷组小鼠肺组织中有大量绿色染色反应，但少于模型组（图2E）；强的松组小鼠肺组织中有较多绿色，但较模型组明显减少（图2F）。对照组、模型组、金丝桃苷高、中、低剂量组、强的松组小鼠肺组织纤维化积分分别为（0.33 ± 0.52）、（2.83 ± 0.41）、（1.00 ± 0.63）、（1.33 ± 1.03）、（1.83 ± 0.98）、（1.83 ± 0.75）分；与对照组比较，模型组小鼠肺纤维化积分明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，各剂量金丝桃苷组、强的松组小鼠肺纤维化积分明显下降（ P < 0.05）。

图 2

注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：金丝桃苷高、中、低剂量组；F：强的松组。 图 2 金丝桃苷对小鼠肺纤维化影响（Masson，× 200）

结果显示，对照组、模型组、金丝桃苷高、中、低剂量组、强的松组小鼠肺组织中HYP含量分别为（0.34 ± 0.17）、（1.26 ± 0.38）、（0.71 ± 0.17）、（0.81 ± 0.23）、（1.09 ± 0.21）、（0.68 ± 0.41）μg/mg；与对照组比较，模型组小鼠肺组织中HYP含量明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，中、高剂量金丝桃苷组、强的松组小鼠肺组织中的HYP含量均明显下降，差异有统计学意义（ P < 0.05）。

免疫组化结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中collagenⅠ和collagen Ⅲ含量明显升高；与模型组比较，金丝桃苷高剂量组和强的松组小鼠肺组织中collagenⅠ和collagenⅢ含量明显下降。

图 3

注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：金丝桃苷高、中、低剂量组；F：强的松组。 图 3 金丝桃苷对小鼠肺组织collagenⅠ表达影响（免疫组化，× 200）

图 4

注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：金丝桃苷高、中、低剂量组；F：强的松组。 图 4 金丝桃苷对小鼠肺组织collagen Ⅲ表达影响（免疫组化，× 200）

与对照组比较，模型组小鼠血清TGF-β1和肺泡灌洗液IL-6含量均明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，高、中剂量金丝桃苷组和强的松组小鼠血清TGF-β1和肺泡灌洗液IL-6含量均明显降低（ P < 0.05）。

表 1

表 1 金丝桃苷对小鼠血清TGF-β1和肺泡灌洗液IL-6含量影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6） 组别（mg/kg） TGF-β1（pg/mL） IL-6（mg/mL） 对照组 48.39 ± 5.24 24.13 ± 3.33 模型组 182.83 ± 11.15a 89.36 ± 7.21a 金丝桃苷组 100 121.37 ± 8.25b 48.25 ± 8.39b 　　　　　50 135.78 ± 17.29c 71.90 ± 7.74c 　　　　　25 175.35 ± 14.89 84.84 ± 10.31 强的松组 112.73 ± 10.23b 44.45 ± 7.15b 　　注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01，c P < 0.05。

表 1 金丝桃苷对小鼠血清TGF-β1和肺泡灌洗液IL-6含量影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 6）

金丝桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，普遍存在于金丝桃科、蔷薇科等植物的果实中，是一种从天然植物中提取的黄酮醇苷类化合物^{[5 – 6]}。目前研究表明，金丝桃苷有抗炎症、抗氧化应激、抗血栓等功效，可有效治疗肝硬化、糖尿病、抑郁症等疾病，然而其在肺纤维化中的价值一直少有报道。肺纤维化基本病理改变为早期的弥漫性肺泡炎和晚期大量成纤维细胞增殖以及基质胶原沉积，最终可发展为弥漫性肺间质纤维化^{[7 – 8]}。向气管内灌注博来霉素为肺纤维化的经典动物模型，在病理过程中与肺纤维化有很多相似之处，是目前应用最广泛、最为成熟的肺纤维化造模方法^[9]。本研究结果显示，造模后小鼠肺泡结构显著破坏，大量炎性细胞浸润（HE），同时可见胶原含量显著升高（Masson），表明肺纤维化模型造模成功；肺泡炎和肺纤维化积分结果显示，与模型组比较，中、高剂量金丝桃苷和强的松组小鼠肺泡炎与肺纤维化积分明显下降。提示，金丝桃苷对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化具有一定的改善作用。

目前研究证实，胶原基质沉积在肺纤维化的发生发展中起着重要作用，而其中主要为collagenⅠ和collagen Ⅲ，羟脯氨酸为胶原蛋白的组成成分，大约可占氨基酸总含量的13 %，通过测定小鼠肺组织中羟脯氨酸含量可评估其胶原蛋白分解代谢的基本情况^{[10 – 11]}。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量明显增加；与模型组比较，中、高剂量金丝桃苷组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量均明显降低；免疫组化结果显示，高剂量金丝桃苷组小鼠肺组织中collagenⅠ和collagen Ⅲ的表达明显低于模型组。提示，金丝桃苷对缓解肺纤维化过程中肺组织的胶原沉积有一定作用。

尽管目前对于肺纤维化的发病机制尚不十分明确，但有证据表明，细胞因子在肺纤维化的发生发展中起着关键作用，它们之间相互调控、相互制约，构成了复杂的细胞因子网络，共同参与肺纤维化进程^[12]。而TGF-β1是研究的最为深入、作用最重要的细胞因子，已被大多数学者公认为是参与肺纤维化进展的关键性细胞因子，参与肺纤维化发生发展的多个环节^{[13 – 14]}。在肺纤维化发生发展过程中有大量淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞增生，这些细胞可分泌IL-6，引起IL-6水平升高，IL-6水平的高低与肺纤维化的严重程度呈正相关^[15]。本研究结果显示，与模型组比较，中、高剂量金丝桃苷组小鼠血清中TGF-β1含量和肺泡灌洗液中IL-6水平均明显降低。提示，金丝桃苷对改善肺纤维化的炎症反应具有一定作用。

综上所述，金丝桃苷对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化具有一定的改善作用，其机制可能与金丝桃苷能够抑制肺组织胶原分泌、抑制炎症反应、抑制细胞因子TGF-β1与IL-6表达有关，而更详细的作用机制有待于进一步的深入研究。