神经胶质瘤是最常见的脑肿瘤，发病率和病死率较高。脑肿瘤血管上存在着血肿瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB），严重限制了亲水性化疗药物到达肿瘤组织^[1]。因此，应用选择性开放BTB的药物成为提高脑肿瘤患者疗效的关键。近年研究发现，小剂量缓激肽（bradykinin，BK）能够选择性增加BTB的通透性，而对正常脑组织的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）几乎没有影响^[2]。但缓激肽只引起BTB短暂开放（15 min），且仅允许1 kDa的分子通过，限制了抗肿瘤药物的应用类型及作用时间^[3]。研究还发现，颈内动脉灌注罂粟碱（papaverine，PA）同样可以选择性开放BTB^[4]。对缓激肽和罂粟碱的作用机制进行研究发现，它们均可引起第二信使cGMP改变，cGMP是调节紧密连接（tight junctions，TJ）相关蛋白中闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）表达的重要因素^{[5 – 6]}。本研究联合应用缓激肽与罂粟碱，通过观察BTB通透性改变、TJ相关蛋白ZO-1的表达变化，探讨两药联合应用开放BTB的协同效应。结果报告如下。

健康成年SD雌性大鼠80只，体重180～200 g，沈阳医学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（辽）2015 – 0001。常规培养C6大鼠胶质瘤细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），用含1.2 %甲基纤维素的DMEM （Dulbecco's modified Eagle's medium）培养基制备C6胶质瘤细胞悬液，浓度为1 × 10 ⁶个/10 μL备用。10 %水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，将制备好的细胞悬液在脑立体定位仪上用微量注射器注入大鼠右侧尾状核头部，靶点为前囟前1 mm，矢状缝旁开3 mm，深4.5 mm。肿瘤种植2周后备用。

肿瘤种植大鼠随机分为4组：对照组，缓激肽组，罂粟碱组，缓激肽+罂粟碱组（联合组）。肿瘤种植2周后将大鼠麻醉，缓激肽组大鼠经颈内动脉以53.3 μL/min（10 μg/kg/min）的速度持续给予BK 15 min；罂粟碱组大鼠经颈内动脉灌注PA，浓度为0.5 mg/kg，30 s内给完；联合组大鼠于PA灌注45 min后缓慢注入BK；对照组给予同剂量的生理盐水；作用时间为60 min。在操作的同时监测大鼠的体温和血压。处死大鼠，进行后续相关指标检测。

BTB通透性采用伊文思蓝（Evans blue，EB）（美国Fluka公司）渗出量定量测定。大鼠经股静脉2 mL/kg体重注入2 % EB，2 h后经左心室灌注生理盐水至流出清亮液体，取右侧半脑，1 mL/100 mg脑肿瘤组织中加人甲酰胺溶液，60 ℃孵育24 h，分光光度计测定620 nm处吸光度（A）值，作出标准曲线，从标准曲线上算出脑肿瘤组织中EB含量（μg/g脑重量）。

采用免疫组织化学法，4 %多聚甲醛灌流，断头取右侧脑肿瘤组织，30 %蔗糖脱水，OTC包埋，冰冻切片机冠状连续切片（厚10 μm）。一抗为兔抗大鼠多克隆抗体，1:200稀释（美国Sigma公司），应用免疫组化法，按试剂盒（武汉博士德公司）说明操作，二氨基联苯胺（武汉博士德公司）显色，结果用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统（麦克奥迪厦门销售有限公司）采集照片，进行定量分析。

采用RT-PCR法，麻醉动物经心脏灌注冰生理盐水约300 mL，取右侧脑肿瘤组织50 mg。按Trizol（美国Sigma公司）试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度仪测定总RNA含量。按RT-PCR试剂盒（Takara公司）操作说明将mRNA逆转录为cDNA，用下列引物（生工生物工程上海股份有限公司合成）对ZO-1及β-actin的cDNA进行扩增：ZO-1（903 bp）上游5′-AAAAGGACGTTTATCGCCGCATT-3′，下游5′-TCCCCTCAGAGACCCACACCAG-3′; β-actin（493 bp）上游5′-GTGGGGCGCCCAGG CACCA-3′，下游5′-GCTCGGCCGTGGTGGTGAAGC-3′，PCR产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察并照相。

所得数据以 $\bar x \pm s$ 表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果显示，对照组、缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中EB含量分别为（0.182 ± 0.026）、（0.487 ± 0.031）、（0.503 ± 0.029）和（0.875 ± 0.040）μg/g。与对照组比较，缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中EB含量均明显增加（P < 0.01）；与缓激肽组或罂粟碱组比较，联合组大鼠脑肿瘤组织中EB含量进一步增加（ P < 0.01）。

结果显示，ZO-1主要表达在微血管内皮细胞和胶质细胞中，对照组、缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1蛋白表达分别为（0.379 ± 0.011）、（0.259 ± 0.008）、（0.252 ± 0.010）和（0.135 ± 0.015）。与对照组比较，缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1蛋白表达明显下降（P < 0.01）；与缓激肽组或罂粟碱组比较，联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1蛋白表达进一步降低（ P < 0.01）。

图 1

注：A对照组；B缓激肽组；C罂粟碱组；D联合组。 图 1 联合应用缓激肽与罂粟碱对大鼠脑肿瘤组织中ZO-1蛋白表达影响（× 400）

结果显示，对照组、缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1 mRNA表达分别为（0.876 ± 0.062）、（0.735 ± 0.036）、（0.695 ± 0.050）和（0.420 ± 0.047）。与对照组比较，缓激肽组、罂粟碱组、联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1 mRNA表达明显下降（P < 0.01）；与缓激肽组或罂粟碱组比较，联合组大鼠脑肿瘤组织中ZO-1 mRNA表达进一步降低（ P < 0.01）。

图 2

注：M marker；1 对照组；2 缓激肽组；3 罂粟碱组；4 联合组。 图 2 联合应用缓激肽与罂粟碱对大鼠脑肿瘤组织中ZO-1 mRNA表达影响

缓激肽是目前研究较多的选择性、可逆性开放BTB的药物。研究表明缓激肽与细胞表面B₂受体结合使细胞膜上钙通道开放，促发“Ca²⁺↑－NO↑－cGMP↑”这一级联反应，cGMP水平升高使TJ开放，最终促使BTB开放^[5]。因为缓激肽能够诱发快速的耐受性而降低其临床应用性。罂粟碱是临床上常用的血管扩张剂，其强大的扩血管作用可使BTB可逆性开放^[6]。目前，罂粟碱开放BTB的作用机制尚不清楚。研究表明，罂粟碱可能通过抑制血管平滑肌上磷酸二酯酶活性使细胞内cGMP增加而发挥作用^[7]。鉴于缓激肽与罂粟碱开放BTB作用机制中均出现cGMP增加，推测两药可能具有协同作用。本研究结果表明与单独应用组比较，缓激肽与罂粟碱联合应用组大鼠脑肿瘤组织中EB含量明显增加。提示，缓激肽与罂粟碱增加BTB通透性作用具有协同效应。

TJ是BBB重要的结构基础，成为离子与分子通过细胞旁途径跨膜转运的主要屏障^[8]。ZO-1是第一个被确定的TJ相关蛋白^[9]，其结构和功能与TJ的其他成分密切相关。研究表明，ZO-1表达水平下调直接导致脑血管内皮细胞间TJ的破坏，肿瘤组织周围BBB的破坏常伴随ZO-1的表达缺失^{[10 – 11]}。本研究结果显示，缓激肽与罂粟碱均可引起肿瘤组织ZO-1表达减少，两药联合应用使其表达水平进一步降低。提示，ZO-1是2药共同的作用靶点之一。cGMP是一种调节多种生化和生理反应的第二信使，细胞内cGMP水平增高可使BTB通透性增加^[12]。研究表明cGMP类似物8-Br-cGMP能够显著降低TJ相关蛋白ZO-1的mRNA及蛋白表达水平^[13]。提示，缓激肽与罂粟碱联合应用开放BTB机制可能与cGMP介导的信号途径下调ZO-1表达水平，进而使TJ通透性增加有关。