2018, Vol. 34
2. 广西医科大学生命科学院;
3. 广西医科大学第一附属医院
室间隔缺损（ventricular septal defect，VSD）是由于胚胎发育期左右两个心室之间的间隔发育不良造成的畸形，是先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）中最常见的一种类型，可占全部CHD的25 %～40 %。目前CHD的产前诊断主要依靠超声心动图技术，但受仪器和诊断技术等因素影响，CHD的产前诊断率并不理想。研究显示，经产前诊断的先天性心脏病例仅占先天性心脏病总数的22.73 %[1]。因此，有必要建立其他的CHD产前诊断技术，如生物标记物检测。粘附分子是一大类膜蛋白，它们介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质以及某些血浆蛋白之间的识别与结合，并参与细胞内外的信号转导，在胚胎发育、正常组织结构的维持、细胞的运动游走、免疫调节、炎症反应、血栓形成、损伤修复等病理生理过程中起重要作用[2]。在心脏组织中，粘附分子是内皮活性的重要指标，主要受肺动脉血流和肺动脉高压的变化影响[3]。细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1）是粘附分子中的一类，属于免疫球蛋白超家族，作为淋巴细胞功能抗原-1、巨噬细胞分化抗原-1的配体，参与白细胞与血管内皮细胞黏附使之向血管外迁移，黏附心肌细胞并释放细胞毒性物质的过程[4]。研究表明，先天性心脏病患儿中肺动脉高压越高，可溶性ICAM-1水平越高[5]，被认为是肺动脉高压诊断和预后的生物标记物[6]。
多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）是一种能在复杂样品中对特定分子进行定量检测的质谱分析技术，它是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式[7]。MRM技术是近年来国际上作为生物标记物研究的一项新技术，越来越受到关注，成为蛋白质组学的一个研究热点。在国内，利用MRM技术对蛋白质组学的研究尚属探索阶段。本研究拟建立ICAM-1蛋白的MRM-mass spectrometry（MS）测定方法，旨在为MRM技术在蛋白质定量方面的运用提供依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂三氟乙酸、碘乙酰胺、二硫苏糖醇、甲酸、碳酸氢铵（美国Sigma公司）；测序级胰蛋白酶（美国Promega公司）；RapiGestTM SF（美国Waters公司）；色谱纯乙腈、色谱纯水（美国Merck公司）。预柱ChromXP nanoLC Trap Column（0.35 mm × 0.5 mm，3 μm，120Á）、分析柱ChromXP nanoLC Column（0.075 mm × 150 mm，3 μm，120Á，美国eksigent公司）。血清样本：招募2014年2 — 6月间在广西医科大学第一附属医院心脏病研究所住院治疗前的0～15岁先天性心脏病室单纯性间隔缺损患者10例，经心脏彩超诊断或心导管造影确诊，排除其他先天畸形；无并发症及合并症，近期无发热、炎症；无外伤，手术病史及其它可能影响检测结果的情况。患者监护人签署知情同意书并采集静脉血，经分离后得到血清样本，– 80 ℃保存。本研究经广西医科大学伦理委员会审查批准。
1.2 主要仪器液质联用质谱仪中，液相部分（美国eksigent公司）为Nano 2D纳升级毛细管液相，配备自动进样系统、二元洗脱泵；质谱部分（美国AB Sciex公司）为4000 QTRAP三重四级杆线性离子阱质谱，配备NanoSpray III source离子源。CentriVap真空冷冻浓缩仪（美国Labconco公司）；Sartorius BSA124S分析天平（德国Sartorius公司）；恒温混匀仪（Eppendorf Thermomixer）。
1.3 样品制备（1）去除高丰度蛋白：取血清10 μL，加入190 μL agilent buffer A，混匀，置0.22 μm超滤管中，16 000 r/min离心10 min，滤液加入至经agilent buffer A浸泡并冲洗的multi affinity removal spin cartridge（MARS）Hu-7HC小柱上，200 g离心30 s，收集滤液；再加入400 μL Agilent Buffer B，200 g离心1 min，收集滤液；重复加入400 μL Agilent Buffer B ，200 g离心1 min，收集滤液；将3次离心所得滤液（即低丰度蛋白）收集于新离心管中。计算滤液体积，合并后的滤液用BCA（bicinchonininc acid）蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。（2）酶切：根据测得溶液的浓度吸取相当于50 μg蛋白溶液，置用100 μL Urea润洗过的10K超滤管中，12 000 r/min离心15 min；加入8 mol/L Urea 200 μL和1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）4 μL，37 ℃恒温混匀仪中60 min；再加入1 mol/L碘醋酸（IAA）12 μL，暗反应30 min，12 000 r/min离心10 min，滤去溶液；加入40 μL 50 mmol/L NH4HCO3, 6.5 μL胰酶，37 ℃酶切过夜；12 000 r/min离心10 min，加水50 μL，12 000 r/min离心10 min，重复1次，所得滤液收集于新离心管，冻干。测定前加入流动相A（98 %水、2 %乙腈、0.1 %甲酸）50 μL充分溶解，配成1 μg/μL血清蛋白酶切液。
1.4 MRM-MS质谱方法建立 1.4.1 多肽的选择和MRM质谱方法建立通过UniProt数据库获取ICAM-1蛋白的全部序列，利用Skyline软件，导出各肽段母子离子对及其测定参数建立MRM质谱方法。其中各肽段母子离子对的去簇电压均使用同一经验值100，碰撞能量CE的经验值按子离子所带电荷多少并根据经验公式计算得到；取1 μg/μL血清样品，用毛细管液相色谱进行分离，质谱仪进行检测，以检查Skyline软件的预测肽段能否在实际血清样品中被检出。
1.4.2 液相分离条件和质谱仪参数设置液相分离条件：流动相A液（2 %乙腈、0.1 %甲酸），流动相B液：（98 %乙腈、0.1 %甲酸）。流动相梯度：0～20 min, A:95 %→20 %，B：5 %→80 %。质谱仪器参数：气帘气25 psi, 雾化气20 psi，喷雾电压2 300 V，接口加热温度150 ℃，去簇电压100 V，碰撞室入口电压10 V；每个MRM离子对的驻留时间均设置为30 ms。第一级四极杆Q1和第三级四极杆Q3的分辨率均设置为“unit”。
1.5 MRM-MS质谱方法优化 1.5.1 母子离子对选择为确保采集到的母子离子对信号真正来自于目标肽段，需要选取最有代表性的子离子。子离子选择原则：以y离子为主，其次是b离子，y离子和b离子均带1～2个电荷。在选定的肽段中，每个母离子选8个子离子进行测试。对得到的MS/MS图进行分析，每个母离子中保留子离子强度足够高的4个子离子，组成母子离子对。
1.5.2 碰撞能量选择在选好的肽段、母子离子对基础上优化碰撞能量CE值。对每个子离子设置11个碰撞能量值，设置的原则是在原来的经验值上递增/递减3，递增/递减5个级别。用设置好的碰撞能量测试血清样品，对得到的MS/MS图进行分析，选择各母子离子对最佳的碰撞能量CE值。
1.5.3 去簇电压选择在选好的肽段、母子离子对及碰撞能量CE值基础上优化去簇电压DP值。对每个子离子设置从75～125，间隔为5的11个去簇电压DP值。用设置好的去簇电压DP值测试血清样品，对得到的MS/MS图进行分析，选择各母子离子对最佳的去簇电压DP值。
1.6 优化后MRM质谱方法验证将选择好的肽段、母子离子对、各母子离子对的最佳碰撞能量CE值和去簇电压DP值组合成一个新的MRM质谱方法，用上述血清样品进行测试以验证优化后的MRM质谱方法是否可行。
2 结 果 2.1 肽段选择从UniProt数据库中获取ICAM-1蛋白序列，经过Skyline软件预测得到ICAM-1蛋白可用于质谱检测的11个肽段，分别为GGSVLVTCSTSCDQPK、LLGIETPLPK、TFLTVYWTPER、ANLTVVLLR、EPAVGEPAEVTTTVLVR、LNPTVTYGNDSFSAK、ASVSVTAEDEGTQR、VTLNGVPAQPLGPR、DGTFPLPIGESVTVTR、DLEGTYLCR、GTPMKPNTQATPP。通过Skyline软件对肽段设置母离子、子离子，去簇电压DP值统一使用100，碰撞能量CE值用经验公式计算得到，初步建立MRM质谱方法。输入质谱的Analyst软件，用蛋白含量为1 μg/μL的血清样品，按Analyst软件运行3次，得到ICAM-1蛋白的11个肽段的质谱提取离子流图。选取其中共洗脱峰丰度较高、峰型好、信噪比低的3个肽段LLGIETPLPK、LNPTVTYGNDSFSAK、VTLNGVPAQPLGPR作为分析指标。
2.2 离子对选择（图1）在选定的肽段中，扩大一倍母子离子对，分别用8对母子离子对进行筛选。经过实际的血清样品检测，发现有些子离子未能得到有效分离，有些子离子虽然能很好地分离，但强度很低。如肽段LLGIETPLPK的8个母子离子对的质谱提取离子流图（图1）所示，其中+2y6、+2y5、+2y4峰型很差，+2y8、+2b3峰型尚可但丰度较低，最后只保留+2y2、+2b2和+2b6 3个子离子，组成540.8368/244.1656、540.8368/227.1754、540.8368/627.3712 3个离子对；同样，肽段LNPTVTYGNDSFSA保留+2y13、+2y9、+2b2离子，组成807.3939/1386.604、807.3939/988.3871、807.3939/228.0843 3个离子对；肽段VTLNGVPAQPLGPR保留+2y7、+2y5、+2b2离子，组成709.9094/738.3757、709.9094/539.28、709.9094/201.0734 3个离子对。从最初的11个肽段88个离子对，最后优选为3个肽段9个离子对，作为下一步验证的目标多肽。
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图 1 肽段LLGIETPLPK的8个母子离子对的质谱提取离子流图 |
2.3 碰撞能量CE值优化（图2、表1）
对优选后母子离子对设置不同碰撞能量CE值，肽段LLGIETPLPK预设的CE值为32.8，LNPTVTYGNDSFSAK预设CE值为44.5，VTLNGVPAQPLGPR预设CE值40.2。经过实际血清样品检测，不同碰撞能量CE值得到的质谱提取离子流图峰强度有所不同，如肽段LLGIETPLPK的 + 2b6离子（质核比为627.321 2）在用预设的CE值32.8逐级递增3和逐级递减3，前后各5个级别，即CE值17.8、20.8、23.8、26.8、29.8、32.8、35.8、38.8、41.8、44.8、47.8分别对血清样品的质核比为540.836 8的母离子进行碰撞，得到的质谱提取离子流图如图2所示。当碰撞能量CE值为35.8时，得到的峰强度最强，因此，该离子对540.836 8/627.3212的最佳碰撞能量CE值为35.8。同理，选择其他肽段的母子离子对的最佳碰撞能量CE值（表1）。
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图 2 肽段LLGIETPLPK的+2b6离子在不同CE值下的质谱提取离子流图 |
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表 1 不同肽段母子离子对的最优碰撞能量CE值 |
2.4 去簇电压DP值优化（表2）
每个母子离子对均用11个去簇电压DP值75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125分别对实际血清样品进行分析。选择最佳去簇电压DP值的方法与碰撞能量的选择方法一样，由此得到各肽段的母子离子对的去簇电压DP值。
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表 2 不同肽段母子离子对的最优去簇电压DP值 |
2.5 优化后MRM质谱方法验证
利用优化后MRM质谱参数对实际血清样品进行检测，得到的每个离子对峰强度均有所增加、峰型也有较大改善。采用优化后的MRM-MS方法，分别检测10份血清样本中ICAM-1蛋白含量，结果显示，ICAM-1蛋白含量均值为（318.40 ± 97.20）ng/mL，与经酶联免疫法测定的结果（330.30 ± 130.24）ng/mL相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨 论由于蛋白质及其产生的酶切肽段具有相同的化学计量值，所以通过选择合适的蛋白质酶切肽段，获取其浓度值，就可以换算成蛋白质浓度。在众多肽定量方法中，MRM技术作为一项较新的LC-MS/MS定量方法，目前正逐步受到蛋白质组学研究者们的关注。
多重反应监测技术是针对目标蛋白质进行靶向定量的一种质谱技术。它基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号干扰，从而得到质谱信息[7]。方法的核心是设定质谱检测规则，根据多肽片段的母离子质核比和碎片离子（子离子）质核比，设定符合规则的母离子进入碰撞室，碰撞完成后，只记录设定子离子信号，其他离子信号不记录。由于经过母离子和子离子的2次选择，消除干扰离子影响，降低了化学背景，故分析的选择性明显提高，同时信噪比也获得了改善[8]。但是，一个蛋白质可以酶切成很多肽段，有些肽段酶切不完全，有些肽段与其他蛋白具有相同序列、有些肽段容易发生可变的修饰，如果对这些肽段进行测定就无法得到目标蛋白质的真正浓度。因此严格选择能够代表目的蛋白的蛋白质酶切肽段在蛋白质定量中显得尤为重要。为使定量肽段更准确的反映蛋白质绝对量，肽段选择一般需要满足如下规则[9 – 10]:（1）不包含漏切位点；（2）必须是与目的蛋白质匹配的唯一性肽段；（3）肽段长度为8～24个氨基酸；（4）不含容易发生可变修饰（如蛋氨酸的氧化等）的氨基酸；（5）肽段的溶解性好；（6）肽段在质谱中响应强。
一般而言，肽段母离子和碎片离子首先应选择较大的碎片离子减少假阳性，其次应有较好的重复性、稳定性，最后还应具有较高的仪器响应值。本研究中，ICAM-1蛋白经Skyline软件预测得到11个肽段88个离子对，通过淘汰那些不能检出的或峰型不规则（不对称，严重拖尾，以及出现裂缝肩峰等）、峰强度低、峰宽过大的肽段母离子和子离子，最后优选得到3个肽段9个离子对，并且建立了9个离子对的MRM定量质谱方法。在这些MRM母–子离子对中的子离子，均为较大片段的带2个电荷的b离子和y离子，使用实际血清样品在质谱中检测也获得了较高的重复性和响应值。本研究所建立的MRM-MS方法可用于临床上先天性室间隔缺损生物标志物ICAM-1蛋白的检测。
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