肠球菌（Entorococcus spp.）的安全性评价存在争议^[1]。一方面肠球菌作为发酵剂（starter）或益生菌（probiotics）应用于食品中；另一方面肠球菌是一种常见的条件致病菌^[2]，能够引起菌血症等感染和食物中毒，有些菌株对多种抗生素具有耐药性。肠球菌广泛分布于土壤、水源等自然环境中以及人和动物的消化道内，是医院获得性感染的重要病原菌之一，大约16 %的医院内感染由肠球菌引起^[3]。肠球菌能够耐受高盐（6.5 %）和高温（60 ℃ 30 min），容易在食品中生长繁殖，因此，食用被肠球菌污染的食品而引起的食物中毒事件时有发生^[2]。随着抗生素大量使用，由于质粒、转座子的传播和突变株的产生，肠球菌产生获得性耐药，尤其对高水平的内酰胺类、糖肽类抗生素的获得性耐药越来越多^[4]。同时，肠球菌携带的耐药基因有可能通过食物链传递给其他食源性致病菌，肠球菌是食源性致病菌耐药基因的储存库^[5]。研究食品及食品中的肠球菌对食品安全和耐药性具有重要意义。本研究对新鲜鸡蛋蛋壳表面肠球菌进行分离鉴定和耐药性检测，旨在为防止食物中毒和减少耐药性的传播提供依据。结果报告如下。

新鲜鸡蛋（邯郸市某规模化养鸡场），共计160个样品；叠氮钠 – 结晶紫 – 七叶苷琼脂（bile esculin azide agar，BEAA）、营养肉汤培养基（nutrient broth，NB）、脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）（北京Solarbio Science & Technology公司）；Oxoid抗微生物药物敏感性试验纸片（英国Oxiod Basingstoke Hampshire公司），14种药敏纸片分别为新霉素（neomycin，N）、青霉素（penicillin，P）、氨苄西林（ampicilin，AMP）、大观霉素（spectinomycin，SH）、恩诺沙星（enrofloxaxcin，EnR）、红霉素（erythrocin，E）、林可霉素（lincomycin，MY）、庆大霉素（gentamycin，CN）、万古霉素（vancomycin，VA）、阿奇霉素（azithromycin，AZM）、强力霉素（doxcycline，DO）、链霉素（streptomycin，S）、氧氟沙星（ofloxacin，OFX）、头孢噻肟（cefotaxime，CTX）；药敏质控菌株为粪肠球菌（ATCC 29212）（中国科学院微生物所菌种保藏中心）。通用细菌引物16s rDNA，上游：5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游：5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，产物为750 bp，由Sangon Biotech（上海）有限公司合成；DNA Marker[Sangon Biotech（上海）有限公司]。PCR仪、凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）；琼脂糖水平电泳仪（北京市六一仪器厂）。

从某养殖场采集新鲜鸡蛋样品，用无菌生理盐水棉拭子擦拭鸡蛋表面1周，将棉拭子置于EP管中，低温运输至实验室，冷藏备用，共采样160个，分别做好标记。将样品在BEAA上进行划线分离，37 ℃培养24 h。观察肠球菌菌落大小、颜色、形态、边缘整齐度和光滑度等细菌菌落特征。挑取BEAA上生长的单菌落接种于脑心浸液肉汤培养基培养24 h，取菌液进行革兰染色，显微镜下观察。

肠球菌分子鉴定采用16S rDNA PCR扩增法，对PCR产物进行测序分析。将BEAA上疑似肠球菌单菌落，采用煮沸法提取肠球菌DNA，PCR扩增采用细菌通用引物，PCR反应体系（25 μL）组成：PCR Master Mix 12.5 μL、样品DNA模板1 μL、引物各0.5 μL，加ddH₂O 10.5 μL补足至25 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s；72 ℃延伸55 s，35个循环；延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物电泳：预先制备1 %琼脂糖凝胶20 mL，凝固前加入2 μL溴化乙锭（ethidium bromide，EB），每孔加入5 μL样品。电泳条件为：电压100 V，时间30 min，用EB染色30 min，置于凝胶成像分析系统中观察并拍照。

将PCR扩增产物送奥美德诺（北京）基因科技有限公司进行测序，对测序结果登录https://www.ncbi.nlm.nih.gov/在线Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）与Genbank数据库的序列进行同源性比对。将测序序列在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上进行16s rDNA序列的同源性比对，同源性大于97 %以上的即可确定为肠球菌。

按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的K-B纸片琼脂扩散法进行肠球菌的药物敏感性检测并判定结果。挑取BEAA上生长并分子鉴定为肠球菌的菌株接种于脑心浸液肉汤培养180 r/min摇菌生长6～8 h，调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度。吸取50 μL菌液涂布于脑心浸液琼脂培养基中，在室温干燥10 min，用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面，并轻轻按压，再置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h，观察结果。根据美国临床试验室标准委员会（CLSI/NCCLS）颁布的抗微生物药物敏感性试验的执行标准判定结果。质控菌为粪肠球菌（ATCC29212）。

在160个样品中，有124个样品在BEAA上生长出乳白色、有光泽圆形菌落，菌落周围呈褐色。液体培养基中的肠球菌进行革兰染色呈阳性，单独或成对或短链排列存在。

结果显示，在750 bp处出现荧光条带，无明显拖尾现象，表明扩增产物纯度较高，能够满足后续基因测序需要。

图 1

注：M：DNA Marker；1~5：鸡蛋样品。 图 1 部分鸡蛋样品16S rDNA引物PCR结果

对样品DNA测序、基因比对，结果表明在160个鲜蛋蛋壳表面共分离到124株肠球菌，分离率为77.5 %。分离到的肠球菌共有5种，其中粪肠球菌（E. faecalis）占58.1 %（93/160）、屎肠球菌（E. faecium）占13.1 %（21/160）、鸟肠球菌（E.avium）占5.0 %（8/160）、鸡肠球菌（E. gallinarum）占1.9 %（3/160）、铅黄肠球菌（E.casseliflavus）占1.2 %（2/160）。

对124株肠球菌进行耐药性检测，14种抗生素均出现不同程度的耐药性，耐药率从高到低依次为：林可霉素、头孢噻肟均为91.94 %（114/124）；恩诺沙星69.35 %（86/124）；阿奇霉素61.29 %（76/124）；庆大霉素54.03 %（67/124）；链霉素45.97 %（57/124）；大观霉素38.71 %（48/124）；强力霉素30.65 %（38/124）；青霉素、万古霉素、氨苄西林均为23.39 %（29/124）；最低的为新霉素、红霉素、氧氟沙星均为15.32 %（19/124）。

表 1

表 1 124株粪肠球菌对14种抗生素的耐药性 抗生素 耐药 中介 敏感 菌株数 耐药率（%） 菌株数 中介率（%） 菌株数 敏感率（%） 新霉素 19 15.32 19 15.32 86 69.35 青霉素 29 23.39 0 0.00 95 76.61 氨苄西林 29 23.39 0 0.00 95 76.61 大观霉素 48 38.71 38 30.65 38 30.65 恩诺沙星 86 69.35 28 22.58 10 8.06 红霉素 19 15.32 105 84.68 0 0.00 林可霉素 114 91.94 10 8.06 0 0.00 庆大霉素 67 54.03 19 15.32 38 30.65 万古霉素 29 23.39 19 15.32 76 61.29 阿奇霉素 76 61.29 48 38.71 0 0.00 强力霉素 38 30.65 19 15.32 67 54.03 链霉素 57 45.97 57 45.97 10 8.06 氧氟沙星 19 15.32 19 15.32 86 69.35 头孢噻肟 114 91.94 10 8.06 0 0.00

表 1 124株粪肠球菌对14种抗生素的耐药性

124株肠球菌中全部表现为多重耐药性，最低为3重耐药，最高为9重耐药。分离菌株中有19株耐受9种抗生素（分别为青霉素、氨苄西林、大观霉素、恩诺沙星、红霉素、林可霉素、万古霉素、阿奇霉素、强力霉素），占16.13 %；15株耐受8种抗生素（分别为新霉素、恩诺沙星、红霉素、林可霉素、阿奇霉素、强力霉素、链霉素、头孢噻肟），占12.10 %；12株耐受7种抗生素（分别为青霉素、恩诺沙星、阿奇霉素、强力霉素、链霉素、头孢噻肟、林可霉素），占9.68 %；21株耐受6种抗生素（分别为恩诺沙星、林可霉素、庆大霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、链霉素），占16.94 %；23株耐受5种抗生素（分别为大观霉素、林可霉素、阿奇霉素、链霉素、头孢噻肟），占18.55 %；16株耐受4种抗生素（分别为庆大霉素、万古霉素、头孢噻肟、氧氟沙星），占12.9 %；18株耐受3种抗生素（分别为林可霉素、链霉素、头孢噻肟），占14.52 %。

肠球菌属于革兰阳性细菌，最初归为链球菌属，被确定为链球菌属D种，随着分子生物学发展，根据16S核糖体序列分析和DNA杂交等方法建立了肠球菌属，1984年正式将肠球菌属列为一个独立的菌属^[6]。截止到目前共有49个种和亚种已被提议列入肠球菌属（http://www.bacterio.net/Enterococcus.html）^[7]。长期以来，肠球菌被认为是对机体无害的共生性细菌，忽视了其致病性等与食品安全有关的问题，近年来，由肠球菌引起的食物中毒常见报道。如市售的熟肉制品中分离出肠球菌（9/40）^[8]，郑州某大学食堂发生的一例由鸡肠球菌（E.gallinarum）引起367名学生食物中毒事件^[9]。提示，应注意肠球菌对食品的污染问题。

肠球菌的表型表现出多样性，这使得对其进行生化鉴定准确度较差，而利用16S rDNA基因分型的方法更加准确快速。本研究结果显示，在新鲜鸡蛋壳表面分离出5种肠球菌，总分离率为77.5 %。高于Ruzauskas等^[10]在家禽产品中分离率36.2 %。本研究分离到的肠球菌主要为粪肠球菌（58.1 %）、屎肠球菌（13.1 %），其次为鸟肠球菌（5.0 %）、鸡肠球菌（1.9 %）、铅黄肠球菌（1.2 %）。而Ruzauskas等^[10]在禽产品中分离到的肠球菌主要为粪肠球菌（29.3 %）和海氏肠球菌（17.2 %）。提示，在新鲜鸡蛋表面存在多种肠球菌，有潜在的致病风险，应予以重视。

肠球菌被认为是致病性细菌耐药基因的天然“存储库”^[11]，其耐药基因可通过食物链传播^[12]。本研究结果显示，从新鲜鸡蛋蛋壳表面分离的肠球菌对14种抗生素均表现出不同程度的耐药和耐药谱广的特点，对林可霉素和头孢噻肟的耐药性 > 90 %，有23.39 %（29/124）的菌株对万古霉素（VA）耐药。而Liu等 ^[13]在山东和北京来自于鸡源453株肠球菌对万古霉素全部敏感。提示，近年来在养殖业中广泛、大量使用抗生素，使得肠球菌耐药性增加，特别是对万古霉素的耐药菌株增加，应予以高度重视。