非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床综合征，是世界范围的一种重要公共健康问题。研究发现体内瘦素（leptin, LEP）水平不仅可影响机体能量代谢，还可能与NAFLD存在关联^{[1 – 3]}。瘦素作为最早被人们所认识的脂肪因子之一，其基因启动子区2548位G > A变异可能从转录水平影响瘦素的表达及循环瘦素水平 ^[4]。但是，国内外有关LEP G2548A多态性与NAFLD关联性的报道很少且研究结果存在争议^{[5 – 6]}。考虑到NAFLD作为一种复杂病因疾病，环境（行为）因素在NAFLD病因和疾病进程方面也起到重要作用。因此，本研究针对NAFLD易感性与LEP G2548A多态性及相关因素间的关联进行研究，并利用叉生分析方法探讨LEP G2548A多态性与吸烟、饮酒等相关因素交互作用对NAFLD发生的影响，为筛检NAFLD易感人群，进行NAFLD预测和预防提供理论依据。结果报告如下。

研究对象来源于2015年3月 — 2016年2月期间在厦门市第二医院体检科健康体检者，NAFLD诊断参照中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组非酒精性脂肪肝诊断标准^[7]。排除乙型病毒性肝炎后肝硬化、酒精性肝硬化及其他代谢性疾病以及无血液标本、无问卷信息的样本。病例组与对照组按性别、年龄（± 2岁）进行1 : 2配比。病例组200例，男103例，女97例，平均年龄（43.55 ± 13.91）岁；对照组400人，男206名，女194名，平均年龄（42.82 ± 12.91）岁。所有研究对象均在厦门市居住 ≥ 3年，均提前告知研究目的并填写知情同意书。

由统一培训的调查员对研究对象进行问卷调查。为减少偏倚，病例相关调查内容以确诊前情况为准，包括一般人口学特征：文化程度、婚姻状况、职业、体质指数（body mass index，BMI）、吸烟、饮酒、饮茶、坚持锻炼等饮食行为习惯。相关因素定义：以前或现在累积吸烟大于100支的为吸烟；不论饮酒类型，每周至少1次，持续6个月以上者为饮酒。进行多因素logistic回归分析时，血压、糖脂水平编码以正常参考值范围为节点，瘦素水平编码以该变量全部病例对照实际数值的均数为节点。

受试对象均在清晨空腹抽取10 mL肘静脉血，– 80 ℃冰箱保存。其中5 mL用依地酸钠钙（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）抗凝管采集后分装至 1.5 mL离心管中，用于提取基因组DNA，作基因多态性分析；另外5 mL使用普通采血管采集，自然沉淀30 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液分装至1.5 mL离心管内，进行血清瘦素及血生化检测。

使用Mag Core® HF16全自动核酸提取仪和Mag Core®基因组DNA全血试剂盒提取静脉血白细胞中的基因组DNA。在200 μL静脉血中加入20 μL蛋白酶K溶液（10 mg/mL），涡旋混匀，按照说明书要求提取DNA，最终洗脱体积为100 μL。采用Infinite® 200 Pro NanoQuant酶标仪测定基因组DNA纯度及浓度。每个样本独立测定纯度及浓度2次，在误差低于5%情况下取2次平均值。A₂₆₀/A₂₈₀值位于1.7～1.9之间的样本表明无蛋白质和RNA污染，DNA纯度合格，可用于后续实验。根据测定的每个基因组样本DNA母液浓度（ng/μL），取部分DNA母液计算后稀释至终浓度（20 ng/μL），并于4 ℃冰箱保存。

针对LEP G2548A多态性位点设计引物，通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）查询该SNP位点的基因组序列，使用Primer Premier 6及Oligo 7.0软件进行引物设计与评价。引物序列为，上游：5′-CATGGGTACTTATACAACAAG-3′，下游：5′-CAACATCTCAGCACTTAGG-3′，扩增片段长度为159 bp。通过UCSC-PCR（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）验证其特异性后由上海生工生物公司合成，引物浓度调整到10 μmol/L，于4 ℃保存。

采用高分辨率溶解曲线技术（high resolution melting curve, HRM），反应总体系为25 μL，包含DNA模板5 μL，25 mmol/L的MgCl₂ 2 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq DNA聚合酶HS（5 U/μL）0.2 μL，各位点上下游引物（10 pmol/μL） 各0.5 μL，20 × EvaGreen饱和荧光染料1 μL，去离子水补充总体积至25 μL。PCR反应条件为 95 ℃预变性5 min后进入主循环，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共 40个循环，完成后72 ℃终末延伸5 min；HRM反应参数：95 ℃变性1 min，40 ℃复性1 min，HRM 65～90 ℃，以0.02 ℃/s的斜率采集溶解曲线，在LightCycler 480荧光定量PCR仪器基因扫描软件模块上进行基因分型。

采用广东欣博盛生物科技有限公司的人瘦素酶联免疫测定试剂盒测定受试对象血清瘦素水平；采用日立7080 全自动生化分析仪测定空腹血糖（fast blood glucose，FBG）、血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）含量。

采用Epi Data 3.0 软件建立数据库，平行双录入，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用Hardy-Weinberg equilibrium检验研究样本的群体代表性，以P > 0. 05为符合Hardy-Weinberg平衡。病例组和对照组之间的基因型频率和等位基因频率采用 χ²检验分析，P < 0. 05 为差异有统计学意义。采用逐步回归法将有统计学意义的因素（ P < 0.10）作为自变量纳入模型，作多因素条件logistic回归分析。利用叉生分析方法分别计算同时暴露于遗传与环境因素的危险性（ OR_{1 × 2}值）以及单独暴露于遗传或环境因素的危险性（OR₁、OR₂值），两者均未暴露的病例和对照组作为共同参照组，判断基于隐性模型（AA/GA + GG）的两因素间交互作用，OR_{1 × 2} = OR₁ × OR₂为相乘模型（无交互作用），OR_{1 × 2} > OR₁ × OR₂为超相乘模型（正向交互作用），OR_{1 × 2} < OR₁ × OR₂为次相乘模型（负向交互作用）。交互作用是否存在还需通过条件logistic回归模型的似然比检验^[8]。

通过HRM溶解分型图，共得到LEP G2548A位点３种基因型，分别为野生型GG，突变杂合型GA和突变纯合型AA；2组随机挑选不同基因型的部分样本（5 %）进行单向测序，测序结果使用Chromas软件分析，经验证，HRM分型结果和测序结果完全一致（图1）。SNP位点在对照组中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ² = 1.86, P = 0.172），所选对照组具有群体代表性；2组人群基因型及等位基因频率分布差异有统计学意义（P < 0.05），且LEP G2548A位点A等位基因及AA基因型携带者患NAFLD的风险分别是G等位基因及GG基因型携带者的1.710和2.461倍。采用显性和隐性2种遗传模型进行分析，结果显示，在隐性模型中，2位点的不同基因型在病例、对照组之间的分布差异均具有统计学意义（ P < 0.01），说明携带AA突变纯合型个体具有NAFLD易感性（ 表1）。

图 1

图 1 HRM溶解分型及测序结果

表 1

表 1 病例组与对照组LEP G2548A基因型与等位基因分布 LEP G2548A 病例组 对照组 χ2值 P值 OR值 95 % CI n % n % 基因型 GG 6 3.0 27 6.8 9.19 0.010 1.000 GA 49 24.5 134 33.5 1.553 0.607～3.969 AA 145 72.5 239 59.7 2.461 1.013～5.981 等位基因 G 61 15.3 188 23.5 11.04 0.001 1.000 A 339 84.7 612 76.5 1.710 1.241～2.350 显性模型 （GA + AA）/GG 194 : 6 373 : 27 3.70 0.054 2.250 0.929～5.450 隐性模型 AA/（GA + GG） 145 : 55 239 : 161 9.41 0.002 1.694 1.187～2.419

表 1 病例组与对照组LEP G2548A基因型与等位基因分布

单因素分析结果显示，BMI、血压、血糖、血清TC、TG、HDLC、leptin水平及吸烟、坚持锻炼在2组之间差异有统计学意义（P < 0.05），年龄、LDLC、文化程度、婚姻状况、职业、饮酒、蔬菜水果及油腻饮食摄入频率在2组之间差异无统计学意义（ P > 0.05）。

在单因素分析基础上采用逐步回归法将有统计学意义的因素作为自变量纳入多因素回归分析模型中。结果显示，血清TC、Leptin水平、血糖、吸烟分别是NAFLD发生的危险因素，坚持锻炼是NAFLD发生的保护因素。

表 2

表 2 NAFLD多因素条件logistic回归分析 变量 参照组 β $ {S_{\overline x}}$ Wald χ2值 P值 OR值 95 % CI TC（mmo1/L） ≥5.20 < 5.20 0.476 0.193 6.110 0.013 1.609 1.104～2.347 Leptin（ng/mL） ≥8.49 < 8.49 0.412 0.198 4.345 0.037 1.510 1.025～2.224 血糖（mmo1/L） ≥6.11 < 6.11 0.868 0.357 5.897 0.015 2.381 1.182～4.797 吸烟 是 否 0.541 0.240 5.089 0.024 1.717 1.074～2.748 坚持锻炼 是 否 – 0.407 0.188 4.708 0.030 0.666 0.461～0.961

表 2 NAFLD多因素条件logistic回归分析

通过对LEP G2548A多态性与包括TC、血糖、leptin、吸烟及坚持锻炼在内的环境因素进行叉生分析，结果显示，分别与携带GA/AA基因型的低leptin水平者和携带GA/AA基因型的低血糖者比较，携带AA基因型的血清高leptin水平者及携带AA基因型的高血糖者发病风险均明显上升，二者间存在正向交互作用（P < 0.01）。而瘦素基因G2548A多态性分别与TC、吸烟及坚持锻炼之间均存在联合作用。

表 3

表 3 LEP G2548A基因多态性与环境因素交互作用分析 基因型 病例组 （n） 对照组 （n） OR值 95 % CI P值 Pa交互 TC （– ） + GA/GG 19 89 1.000 0.689 TC （– ） +AA 64 118 2.541 1.421～4.544 0.001 TC （+） + GA/GG 36 73 2.310 1.223～4.364 0.009 TC （+） + AA 82 121 3.174 1.797～5.609 < 0.001 FBG （– ） + GA/GG 49 151 1.000 0.009 FBG （– ） + AA 130 228 1.757 1.192～2.589 0.004 FBG （+） + GA/GG 6 10 1.849 0.639～5.349 0.395 FBG （+） + AA 15 11 4.202 1.810～9.755 < 0.001 Leptin （–） + GA/GG 28 89 1.000 0.007 Leptin （–） + AA 63 123 1.628 0.966～2.744 0.066 Leptin （+） + GA/GG 27 72 1.192 0.646～2.201 0.574 Leptin （+） + AA 82 116 2.247 1.349～3.743 0.002 吸烟 （– ） + GA/GG 33 113 1.000 0.543 吸烟 （– ） + AA 96 176 1.868 1.178～2.961 0.007 吸烟 （+） + GA/GG 22 53 1.421 0.757～2.670 0.273 吸烟 （+） + AA 49 58 2.893 1.680～4.980 < 0.001 坚持锻炼（– ） + GA/GG 38 96 1.000 0.585 坚持锻炼（– ） + AA 101 144 1.772 1.126～2.789 0.013 坚持锻炼（+） + GA/GG 17 65 0.661 0.344～1.269 0.212 坚持锻炼（+） + AA 44 95 1.170 0.697～1.965 0.553 　　注：a 交互作用矫正了年龄、性别及其余变量。

表 3 LEP G2548A基因多态性与环境因素交互作用分析

NAFLD发病机制极为复杂，与遗传、环境、代谢等因素密切相关，但目前尚未完全阐明。胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）在NAFLD发病中起关键作用，可减弱胰岛素对脂肪代谢的调节作用，促使脂肪组织分解，释放过多的游离脂肪酸（free fat acid, FFA），一旦超过肝脏代偿能力，会引起肝脏内脂质沉积，增加NAFLD发生风险^{[9 – 10]}。体力活动是人体能量消耗的重要途径，适量运动能去除腹部内脏脂肪，改善IR，减少糖向脂肪和糖原的转化，促进脂肪氧化分解，从而降低脂肪过度堆积引发脂肪肝的危险性。Athyros等^[11]认为吸烟可能是NAFLD发生的一项危险因素。一方面，香烟中的尼古丁和一氧化碳均能刺激交感神经释放儿茶酚胺，使血浆游离脂肪酸水平升高并被肝脏和脂肪组织摄取而合成甘油三酯；另一方面，香烟中的尼古丁和一氧化碳等毒性成分进入人体后，通过血液循环输送至肝脏，当这些毒物超过肝脏的代偿能力时，肝脏的脂肪代谢则会受阻，从而引发脂肪肝。本研究结果显示，NAFLD组患者的BMI、血压、血糖、血清TC、TG、LDLC水平均明显高于对照组；在矫正其他影响因素后，糖脂代谢紊乱（高血糖、高胆固醇）、缺乏运动和吸烟是NAFLD发病的重要危险因素，与以往相关研究结果一致^{[12 – 14]}。

关于NAFLD患者循环瘦素水平的研究结果备受争议，血清瘦素水平往往与体内脂肪量成正比，而过高的血清瘦素水平会导致瘦素抵抗^[15]。有研究发现瘦素在NAFLD患者中呈现出较高水平^{[16 – 17]}，亦有研究表明体内瘦素水平在2组间差异无统计学意义^{[18 – 19]}。瘦素高水平表达可能从以下2方面影响NAFLD的发生和发展。一方面，NAFLD患者体内存在瘦素抵抗，通过参与肝脏脂肪浸润、炎症及纤维变性过程，最终导致肝脏损伤^[20]。另一方面，瘦素代谢障碍促进下丘脑分泌神经肽Y，降低瘦素抑制胰岛素分泌能力，通过IR作用增加脂肪沉积，促进NAFLD的发生与发展^{[9 – 10]}。本研究结果显示，病例组患者瘦素水平明显高于对照组，在矫正其他影响因素后差异仍有统计学意义。提示，瘦素水平可能是NAFLD发生的一项独立危险因素。研究表明瘦素G2548A位点G等位基因与血清leptin水平相关，且是女性NAFLD发生的危险因素^[6]。然而，本研究结果与丁百静等^[5]研究结果相似，瘦素G2548A G > A变异与NAFLD存在统计学关联，携带A等位基因和AA基因型个体可能对NAFLD更加易感。研究结果的差异，可能与不同地区的研究人群（年龄、性别、样本数等）、环境暴露及基因频率分布差异有关。

NAFLD作为一种复杂多因素疾病，是基因与环境（行为）因素共同作用的结果，这些因素之间往往存在着复杂的交互作用。以往关于基因 – 环境（行为）因素间交互作用与NAFLD关联性研究不多。张超贤等 ^[21]对600例NAFLD患者及600例健康对照研究发现，Gln223Arg/ MnSOD9Ala/Val基因多态性与吸烟的交互作用增加了NAFLD发病风险。李玉华等^[22]认为ApoB基因多态性与腰臀比、高脂血症病史和多坐少动生活节奏等环境因素对NAFLD发病存在明显交互作用。本研究结果表明瘦素G2548A多态性分别与血清leptin水平和血糖间存在正向交互作用。提示，携带AA基因型的血清高Leptin水平者及携带AA基因型的高血糖者较其他交互组合罹患NAFLD风险更大。国内学者^[5]对98名II型糖尿病（T2MD）合并NAFLD患者及110名单纯T2MD （type 2 diabetes mellitus）患者研究发现，瘦素 –2548AA基因型可能通过调控机体脂肪分布，促进T2MD合并NAFLD的发生。肝脏脂肪堆积可造成机体脂肪代谢障碍，引发高甘油三酯血症从而导致IR。外周组织对胰岛素敏感性降低，导致糖代谢异常，促使血糖升高，诱发T2MD，而T2MD又是NAFLD发生的一项重要危险因素。瘦素与胰岛素之间存在瘦素 – 胰岛素抵抗。一方面, 胰岛素可增加瘦素mRNA表达, 增加瘦素的血浆浓度；另一方面，瘦素通过增加ATP依赖性K ⁺离子通道（ATP-sensitive potassium channels, KATP）开放来抑制胰岛素分泌^[23]。瘦素还能模拟胰岛素通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K）途径发挥葡萄糖转运和糖原合成作用，该途径同样被发现可能是调控NAFLD信号转导途径^[24]。因此，上述机制可能是血清高leptin水平与高血糖可单独增加及分别与LEP G2548A协同增加NAFLD发生风险的重要原因。

综上所述，在行为习惯方面，糖代谢紊乱（高血糖、高胆固醇）、缺乏运动和吸烟可能是NAFLD发病的重要危险因素；在瘦素水平方面，高瘦素水平可能是NAFLD发生的一项独立危险因素；在基因水平上，携带A等位基因和AA基因型个体可能对NAFLD更易感；基因与环境交互作用分析提示，携带AA基因型的血清高leptin水平者及携带AA基因型的高血糖者较其他交互组合罹患NAFLD的风险更大。