2018, Vol. 34
2. 南方医科大学南方医院感染内科;
3. 广东省疾病预防控制中心;
4. 南方医科大学珠江医院医院感染管理科
香港海鸥菌（Laribacter hongkongensis，LH）是一种新发现的能引起社区性肠胃炎和旅游者腹泻的细菌种属[1 – 2]。淡水鱼已被证实为该菌的主要储存宿主[3]，随着对该菌研究的进一步深入，Feng等[4]在59.5 %虎纹蛙肠道内分离到香港海鸥菌，提示蛙可能也是香港海鸥菌的主要储存宿主，同时也可能是人类感染香港海鸥菌的重要来源。目前，香港海鸥菌在人群中的分离率相对较低，对于香港海鸥菌耐药性研究主要局限于淡水鱼分离株，而关于蛙源分离株耐药情况和耐药机制的研究鲜见报道。为了解广东省不同宿主来源香港海鸥菌的耐药表型及耐药基因携带情况，本研究于2015年1月—2016年8月对分离自淡水产品鱼、蛙肠道及病人粪便的122株香港海鸥菌检测了临床常用13种抗生素的耐药表型和所携带的磺胺类、四环素类、红霉素类和喹诺酮类等9种耐药基因，并比较了不同宿主来源香港海鸥菌的耐药性和耐药基因携带率的差别。
1 材料与方法 1.1 菌株来源117株鱼源和蛙源菌株于2015年1月 — 2016年8月分离自广州、深圳、江门等地，包括深圳54株，广州63株，其中62株分离自草鱼肠道，55株分离自虎纹蛙肠道。5株人源菌株为本实验室保存，包括广州1株，香港2株，（香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠），江门2株[5]，其中1株人源株分离自肝病病人粪便，其他4株人源株分离自腹泻病人粪便。所有菌株均进行脲酶、精氨酸双水解酶和三糖铁试验，符合香港海鸥菌生化特性的菌株再采用API20NE生化试验确认[6]。
1.2 特异性片段聚合酶链反应、16S rRNA扩增（表1）采用水煮法提取菌株DNA。PCR扩增16S rRNA特异性序列，具体引物见表1中LPW264和LPW265[7]，目的片段大小550 bp。扩增产物电泳结果阳性的进一步扩增16S rRNA基因全序列，目的片段大小1 495 bp[7], 取5 μL PCR产物经1.0 %琼脂凝胶电泳后在凝胶成像系统中观察。
|
表 1 检测LH相关基因的引物序列 |
1.3 药敏试验
采用K-B纸片扩散法检测13种抗生素的敏感性，药敏纸片包括：头孢噻吩（30 μg）、头孢吡肟（30 μg）；氨苄西林（10 μg）；亚胺培南（10 μg）、氨曲南（30 μg）；阿米卡星（30 μg）、链霉素（10 μg）；红霉素（15 μg）；环丙沙星（5 μg）；四环素（30 μg）；氯霉素（30 μg）；复方新诺明（1.25 μg + 23.75 μg）；利福平（5 μg）。大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌，结果判读根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）标准[8]判读。
1.4 耐药基因引物设计与PCR扩增四环素耐药基因（tetA、tetB、tetM）；磺胺类耐药基因（sul1、sul2）；红霉素耐药基因（ermB、ereA）；喹诺酮类耐药基因（qnrA、aac（6′）-ib），参照文献[9 – 12]设计相应引物。引物由北京六合华大科技有限公司合成。反应体系:总体积：50 μL，其中10 × PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L MgCl2 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4μL，5 U/μL TaqDNA聚合酶0.25 μL，0.6 mmol/L引物各1 μL，模版DNA 5 μL，双蒸水29.75 μL。反应条件为94.0 ℃ 5 min，94.0 ℃ 40 S，68.0 ℃（具体退火温度，见表1）40 S，72.0 ℃ 1 k bp/min，35个循环，72.0 ℃ 10 min。取5 μLPCR产物经1.0 %琼脂凝胶电泳，紫外灯下观察。
1.5 统计分析数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，鱼源株和蛙源株耐药率和耐药基因携带率的比较采用χ2检验或Fisher概率检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 耐药表型（表2）122株香港海鸥菌对13种抗生素均表现为不同水平的的耐药性。对利福平、头孢噻吩、氨苄西林、复方新诺明、红霉素、四环素、环丙沙星、链霉素、氯霉素、氨曲南、头孢吡肟、阿米卡星、亚胺培南的耐药率分别是86.9 %、78.6 %、48.7 %、30.8 %、18.9 %、18.0 %、14.5 %、12.3 %、7.4 %、6.0 %、5.7 %、1.6 %、0.8 %。其中70株菌（57.4％）对3类及以上抗生素耐药，18株菌（14.8 %）对6类及以上抗生素耐药。鱼源株对氨苄西林、头孢噻吩、红霉素、利福平的耐药率高于蛙源株（P分别为0.000、0.004、0.035、0.011），而对四环素、环丙沙星、复方新诺明和链霉素的耐药率则低于蛙源株（P分别为0.000、0.000、0.000、0.011），其他差异没有统计学意义（P均 > 0.05）。5株人源株中，对氨苄西林、头孢噻吩和利福平表现为耐药的分别有3、3和4株，其余均表现为敏感或者中介。
|
|
表 2 122株香港海鸥菌的耐药表型结果 |
2.2 耐药基因（图1、表3）
122株香港海鸥菌所携带的6种耐药基因的部分PCR扩增结果见图1。磺胺类抗性基因sul1、sul2，四环素抗性基因tetA、tetB，红霉素抗性基因ereA，喹诺酮抗性基因aac（6′）-ib均有一定的检出，检出率依次为25.4 %、14.8 %、30.3 %、32.0 %、5.7 %、4.9 %，具体见表3。tetM、ermB、qnrA3种耐药基因未检出。其中分别有14、16株四环素中介的菌株也检测出耐药基因tetA、tetR，有3株磺胺类敏感的菌株检测出sul1。在5株人源菌中，仅1株对四环素表现为中介的菌株检测出tetA和tetR，其余耐药基因未检出。对鱼源和蛙源菌株的这6种耐药基因分布作进一步比较发现：对所有检出的耐药基因sul1、sul2、tetA、tetR、aac（6′）-ib和ereA，蛙源株的携带率均高于鱼源株（P分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.009、0.050）。
|
注：1：2 000 DNA Marker；2、6、10、13、16、19分别为tetA、tetR、sul1、sul2、ereA、aac（6′）-ib标准对照样本；5、9、11、18、22：分别为tetA、tetR、sul1、ereA、aac（6′）-ib阳性样本；其余为阴性样本。 图 1 tetA、tetR、sul1、sul2、ereA、aac（6′）-ib PCR产物电泳图，目标片段大小分别是1 134、525、417、287、721和482 bp。 |
|
|
表 3 122株香港海鸥菌耐药基因检测结果 |
2.3 耐药基因在耐药菌株中的检出率
在122株香港海鸥菌分离株中有36株具有磺胺类抗性，23株具有红霉素抗性，22株具有四环素抗性，17株具有喹诺酮类抗性。在具有磺胺类抗性的36株菌株中，分别有31、18株携带sul1、sul2基因，检出率分别为86.1 %（31/36）、50.0 %（18/36）；23株具有红霉素抗性菌株中，7株携带ereA基因，检出率为30.4 %（7/23）；22株分离菌株具有四环素抗性，其中16株携带tetA基因，15株携带tetR基因，检出率分别为72.7 %（16/22）、68.2 %（15/22）；具有喹诺酮抗性的菌株所携带的耐药基因是aac（6′）-ib基因，检出率是35.3 %（6/17）。
3 讨 论目前，随着抗生素的广泛使用，导致细菌的耐药现象越来越普遍，细菌耐药性已成为威胁全球人类及动物安全的重大问题[13]。本研究中，122株不同宿主来源的香港海鸥菌对利福平表现为高耐药率，对第四代头孢菌素类、青霉素类、磺胺类、红霉素类、四环素类、喹诺酮类也表现为一定的耐药。对该菌的的耐药谱进一步分析发现，有70株菌对 ≥ 3种抗生素耐药，多重耐药率达到了57.4 %，表明香港海鸥菌的耐药性较为严重。作为一种新发现的病原菌，香港海鸥菌的耐药机制尚不清楚，我们同时对其携带的磺胺类、四环素类、喹诺酮类和红霉素类等9种耐药基因进行了检测，共检出sul1、sul2、tetA、tetR、ereA和aac（6′）-ib等6种耐药基因。
为进一步了解不同宿主来源香港海鸥菌的耐药情况，本研究比较了鱼源株和蛙源菌株的耐药性和耐药基因分布的差异。结果表明，鱼源株对氨苄西林、头孢噻吩、红霉素、利福平的耐药率高于蛙源株，而对四环素、环丙沙星、复方新诺明和链霉素的耐药率则低于蛙源株，同时蛙源株的sul1、sul2，tetA、tetR、aac（6′） -ib和ereA等6种耐药基因携带率均高于鱼源株，提示鱼源株和蛙源株对这13类临床常用抗生素表现不同程度的耐药性，可能具有不同的耐药模式。5株人源菌株除对氨苄西林、头孢噻吩和利福平3类抗生素表现为较高耐药性外，对其他10类抗生素均表现为中介或者敏感，其耐药水平明显低于鱼源和蛙源菌株，因人源株数量较少，未进行耐药性的差异性比较。在我国水产养殖业大量使用抗生素进行疾病防治，特别是磺胺类、四环素和喹诺酮类抗生素应用广泛[14]，这可能是鱼源、蛙源香港海鸥菌对这些抗生素具有一定耐药性的原因之一。
在分析联系耐药性和耐药基因之间的联系时发现，磺胺类耐药基因sul1、sul2和四环素类耐药基因tetA、tetR分别在磺胺类和四环素类的耐药菌株中的检出率较高，均超过50 %，提示这4种耐药基因可能是是香港海鸥菌对磺胺类和四环素类耐药的主要原因，但具有红霉素和喹诺酮抗性的菌株中相应耐药基因ereA和aac（6′）-Ib检出率分别为30.4 %和35.3 %，、而eremB和qnrA基因均未检出，提示香港海鸥菌对这两种抗生素耐药还存在其他的耐药机制。有研究显示，与红霉素耐药相关的基因除核糖体甲基化酶基因eremB、红霉素酯酶ereA外，还有主动外排转运基因mefA和红霉素磷酸转移酶mphA、mphB等[10, 15]；喹诺酮类耐药机制的研究显示，喹诺酮类耐药决定区gyrA和parC基因的突变与耐环丙沙星抗生素有关[11]，这些基因在香港海鸥菌的分布情况及其可能发挥的作用值得进一步分析。
由于细菌耐药的分子机制复杂，常常出现多种机制同时参与细菌耐药表型的调控，如钝化酶、靶位改变、膜通透性改变、外排泵等，因此从分子水平进行耐药性研究对解析细菌耐药机制具有重要意义。本研究不仅比较了不同宿主来源香港海鸥菌的耐药谱和耐药基因的携带情况，还进一步分析了耐药基因在耐药菌株中的分布情况，为香港海鸥型菌的耐药性研究提供了流行病学数据。
| [1] | Yuen KY, Woo PC, Teng JL, et al. Laribacter hongkongensis gen. nov., sp. nov., a novel gram-negative bacterium isolated from a cirrhotic patient with bacteremia and empyema [J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(12): 4227–4232. DOI:10.1128/JCM.39.12.4227-4232.2001 |
| [2] | Woo PCY, Lau SKP, Teng JLL, et al. Association of Laribacter hongkongensis in community-acquired gastroenteritis with travel and eating fish: a multicentre case-control study [J]. The Lancet, 2004, 363(9425): 1941–1947. DOI:10.1016/S0140-6736(04)16407-6 |
| [3] | Teng JL, Woo PC, Ma SS, et al. Ecoepidemiology of Laribacter hongkongensis, a novel bacterium associated with gastroenteritis [J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(2): 919–922. DOI:10.1128/JCM.43.2.919-922.2005 |
| [4] | Feng JL, Yan H, Chowdhury N, et al. Identification and characterization of integron-associated antibiotic resistantLaribacter hongkongensis isolated from aquatic products in China [J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 144(3): 337–341. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.10.014 |
| [5] | 朱江峰, 郑南才, 廖如燕, 等. 广东省香港海鸥菌感染性腹泻1例分析[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(4): 403–405. DOI:10.11847/zgggws2011-27-04-10 |
| [6] | 王祉蕴, 冯梅, 刘志华, 等. 广州市香港海鸥菌检测及耐药性分析[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(4): 473–475. DOI:10.11847/zgggws2015-31-04-28 |
| [7] | 冯梅, 刘优招, 何雅青, 等. 深圳市某区淡水产品中香港海鸥菌的检测及耐药特征分析[J]. 中华疾病控制杂志, 2016, 20(8): 764–767. |
| [8] | Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically M7-A7[S]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. |
| [9] | 罗毓婷, 陈定强, 杨羚, 等. 香港海鸥型菌四环素耐药性及其耐药分子机制研究[J]. 实用医学杂志, 2013, 29(4): 630–632. |
| [10] | 杨锦红, 周义正, 刘立雪, 等. 儿童肺炎链球菌红霉素、四环素相关耐药基因的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(5): 866–869. |
| [11] | Chen DQ, Yang L, Luo YT, et al. Prevalence and characterization of quinolone resistance in Laribacter hongkongensis from grass carp and Chinese tiger frog [J]. Journal of Medical Microbiology, 2013, 62(10): 1559–1564. |
| [12] | 陈冰, 冯嘉丽, 李美霞, 等. 耐复方新诺明香港海鸥型菌中I类整合子、磺胺类耐药基因(sul1、sul2)的检测 [J]. 中国人兽共患病杂志, 2012, 28(3): 223–225. |
| [13] | Valeriani F, Giampaoli S, Buggiotti L, et al. Molecular enrichment for detection of S. aureus in recreational waters [J]. Water Science and Technology, 2012, 66(11): 2305–2310. DOI:10.2166/wst.2012.435 |
| [14] | Jiang HX, Tang D, Liu YH, et al. Prevalence and characteristics of β-lactamase and plasmid-mediated quinolone resistance genes inEscherichia coli isolated from farmed fish in China [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2012, 67(10): 2350–2353. DOI:10.1093/jac/dks250 |
| [15] | 林广城, 黄烈, 刘键, 等. 葡萄球菌大环内酯类耐药基因检测及其意义[J]. 中国热带医学, 2006, 6(11): 1926–1927. DOI:10.3969/j.issn.1009-9727.2006.11.003 |