慢性乙醇中毒已是全球性社会问题，可引起多种疾病，其中以乙醇性脑病较多见^[1]。乙醇具有脂溶性和亲神经性，可迅速通过血脑屏障和神经细胞膜。海马是学习记忆的关键脑区，是调控学习记忆功能的结构基础。研究表明：乙醇引起的脑功能损害在海马中较为显著^[2]，乙醇可抑制海马神经元的成熟分化，导致学习记忆功能失调^[3]。Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin （PI3K/Akt/mTOR） 信号通路在长时记忆的形成中具有重要作用^[4]。在雄性小鼠的伏隔核中，AKT的激活参与了乙醇引起的学习记忆的下降^[5]。一些治疗乙醇中毒药物[如metabotropic glutamate receptorsm（GluR5）拮抗剂]，对成年雄性小鼠具有一定作用，但对于成年雌性小鼠作用却不明显^[6]。由此推测：小鼠海马PI3K/Akt/mTOR信号通路可能参与乙醇对小鼠学习记忆的影响，且存在性别差异。本研究拟采用Morris水迷宫对雌雄小鼠慢性乙醇摄入引起的认知功能改变进行评价，并通过Western blot法检测雌雄小鼠海马结构PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达差异，为揭示慢性乙醇中毒影响认知功能提供新的分子机制。

雌、雄8w龄昆明种小鼠（辽宁长生生物技术有限公司）120只，体质量（30 ± 3）g，清洁级，自由摄食、饮水。经1 w适应期饲养，将雌、雄小鼠随机各分成4组（对照组及低、中、高剂量乙醇组），每组15只。低、中、高剂量组乙醇浓度分别为12.5 %、25 %、50 %，对照组为等量蒸馏水。每天于早8点对小鼠进行灌胃给药（0.1 mL/10 g），连续9 w。

乙醇（分析纯，≥ 99.7 %，北京化工厂），根据实验所需浓度每天灌胃给药前临时配制；sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）试剂盒、bicinchoninic acid（BCA）蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒（KeyGEN BioTECH）；抗p-mTOR（ser2448）单克隆抗体（Immunoway）；抗p-Akt（ser473）单克隆抗体（Abcam）；β-actin单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP（KeyGEN BioTECH）；HRP化学发光底物液（Thermo）。Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）；低温超速离心机（德国Heraeus Sepatech公司）；ELx800酶标仪（美国BioTek公司）；Heros-MoleTL2020高通量组织研磨仪（北京鼎号源科技有限公司）；Bio-Rad电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；MF-ChemiBIS2.0凝胶成像系统（以色列DNR公司）；M200 PRO多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）。

乙醇给药后第63 d，使用Morris水迷宫跟踪分析系统对各组小鼠进行定位航行及空间探索实验，检测其学习和记忆能力。（1）定位航行实验（反映空间记忆的获得能力）：于实验第63 d，停止给药。对各组小鼠进行水迷宫训练5 d，每天训练2次（上午10点，下午15点），每次60 s。将小鼠面朝池壁放入水中，同时启动记录装置，通过该系统的图像分析软件可获得小鼠在水中的逃避潜伏期。小鼠找到并爬上平台停留5 s以上定义为有效，若小鼠入水后60 s内未能找到并爬上平台，则将其引导至平台上停留10 s，此时逃避潜伏期记录为60 s。每次训练完成后，迅速将小鼠擦干，防止低体温。每天各小鼠逃避潜伏期用2次训练的均值表示。（2）空间探索实验（检测空间记忆的保持能力）：实验第6 d撤去平台，将小鼠从固定象限中点面朝池壁放入水中，记录其60 s池内活动情况，通过该系统的图像分析软件获得小鼠在有效区的停留距离。

完成空间探索实验后立即断头处死小鼠，冰上分离左侧海马，置于 – 80 ℃保存。

取小鼠海马组织，加入组织裂解液150 μL匀浆，12 000 r/min离心5 min，取上清液，采取BCA法测定蛋白浓度（按照试剂盒说明操作）。取20 μg样品于6 %的分离胶中进行SDS-PAGE电泳分离（上层为5 %浓缩胶），170 mA湿转140 min，转膜后将polyvinylidene fluoride（PVDF）膜置于5 %脱脂奶粉中室温振荡封闭1 h，Tris-buffered saline/Tween（TBST）漂洗3次，每次10 min，按实验要求分别加入抗p-Akt单克隆抗体（1 : 2 000）、抗p-mTOR单克隆抗体（1 : 2 000）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗4次，每次10 min，再与辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG（1 : 5 000）室温振荡孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，将horseradish peroxidase（HRP）化学发光底物液覆盖在PVDF膜上，室温孵育5 min，放置于凝胶成像系统摄片，并用Image J软件进行蛋白印迹条带灰度的定量分析。每个样品测定3次，求得平均吸光度值进行统计分析。将使用抗β-actin单克隆抗体（1 : 1 500）获得的β-actin蛋白印迹条带作为加样内参。

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，数据以 $\bar x \pm s$ 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey’s检验，P < 0. 05 为差异有统计学意义。

Morris水迷宫定位航行实验结果表明：各组雌鼠第5 d逃避潜伏期均值较本组第1 d均值明显缩短（P < 0.05）。空间探索实验结果表明：50 %乙醇组与对照组相比有效区停留距离明显减短，差异有统计学意义（ P < 0.05）。

表 1

表 1 各组雌鼠Morris水迷宫学习记忆行为学检测结果（ $\bar x \pm s$ ） 组别 n 逃避潜伏期（s） 有效停留距离（cm） 第1天 第5天 第6天 对照组 8 54.64 ± 5.23 24.49 ± 8.20a 37.72 ± 1.78 12.5 %乙醇组 8 55.22 ± 4.62 28.34 ± 9.88a 30.23 ± 5.66 25 % 乙醇组 8 56.25 ± 3.43 29.13 ± 12.55a 27.11 ± 7.14 50 % 乙醇组 8 58.33 ± 0.85 34.46 ± 13.13a 20.88 ± 2.73 b 　　注：与各自组第1 d比较，a P < 0.05；与对照组比较b P < 0.05。

表 1 各组雌鼠Morris水迷宫学习记忆行为学检测结果（ $\bar x \pm s$ ）

Morris水迷宫定位航行实验结果表明：各组雄鼠第5 d逃避潜伏期均值较本组第1 d均值明显缩短（P < 0.05）。空间探索实验结果表明：25 %乙醇组、50 %乙醇组与对照组相比有效区停留距离明显减短，差异有统计学意义（ P < 0.05）。

表 2

表 2 各组雄鼠Morris水迷宫学习记忆行为学检测（ $\bar x \pm s$ ） 组别 n 逃避潜伏期（s） 有效停留距离（cm） 第1天 第5天 第6天 对照组 8 54.16 ± 3.91 24.46 ± 5.05a 37.65 ± 6.31 12.5 %乙醇组 8 55.69 ± 4.16 36.02 ± 9.17a 23.63 ± 6.89 25 % 乙醇组 8 56.89 ± 2.80 38.76 ± 6.63a 20.19 ± 3.07b 50 % 乙醇组 8 58.34 ± 1.44 43.06 ± 8.06a 10.33 ± 3.07b 　　注：与各自组第1 d比较，a P < 0.05；与对照组比较b P < 0.05。

表 2 各组雄鼠Morris水迷宫学习记忆行为学检测（ $\bar x \pm s$ ）

Morris水迷宫空间探索结果表明：与相同给药浓度的雄鼠比较，12.5 %乙醇组、25 %乙醇组雌鼠的有效区停留距离稍增加，但差异无统计学意义。50 %乙醇组雌鼠的有效区停留距离明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。

图 1

注：50 %乙醇组雌雄鼠比较，*P < 0.05 图 1 雌雄小鼠有效区停留距离比较

对慢性乙醇染毒的雄雌小鼠进行海马p-Akt蛋白检测：对照组与各乙醇染毒组小鼠均显示出特异性的p-Akt蛋白条带，分子量均为60 kDa。将各组目的蛋白条带与对应的 β-actin条带进行灰度对比分析，计算出p-Akt蛋白的相对表达量。与对照组相比，12.5 %及25 %乙醇组雌鼠p-Akt蛋白表达稍有降低，50 %乙醇组雌鼠p-Akt蛋白表达稍有增加，差异均无统计学意义（图2A）。与对照组相比，50 %乙醇组雄鼠p-Akt蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。

图 2

注：50 %乙醇组雄鼠与其对照组相比，*P < 0.05 图 2 雌雄小鼠海马结构内p-Akt蛋白表达的差异

对慢性乙醇染毒的雄雌小鼠进行海马p-mTOR蛋白检测：对照组与各乙醇染毒组小鼠均显示出特异性的p-mTOR蛋白条带，分子量为289 KD。将各组目的蛋白条带与对应的 β-actin条带进行灰度对比分析，计算出p-mTOR蛋白的相对表达量。与对照组相比，12.5 %乙醇组雌鼠p-mTOR蛋白表达稍有增加，25 %及50 %乙醇组雌鼠p-mTOR蛋白表达稍有降低，差异均无统计学意义。与对照组相比，12.5 %及25 %乙醇组雄鼠p-mTOR蛋白表达稍有降低，但差异无统计学意义；50 %乙醇组雄鼠p-mTOR蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。

图 3

注：50 %乙醇组雄鼠与其对照组相比，*P < 0.05 图 3 雌雄小鼠海马结构内p-mTOR蛋白表达的差异

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）属磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白家族成员，在PI3K-Akt-mTOR信号通路中，mTOR是一种参与翻译调控和突触可塑性的蛋白激酶，在合成蛋白质翻译的起始阶段起到了重要作用。激活的Akt直接作用于mTOR，调控细胞生长与增殖，而Ser473位点的磷酸化是Akt激活的必要条件。海马结构是参与学习记忆的重要脑区，海马功能的不对称性是有关记忆形成和记忆维持的重要因素^[7]。Samara^[8]等对大鼠海马进行的蛋白组学研究发现：某些蛋白在左侧海马表达较右侧为多，且左侧海马神经保护作用较强。此外，在记忆痕迹的形成和信息传递方面，左侧海马占有优势^[9]。研究表明：mTOR信号通路参与生长素诱导的海马神经干细胞的增殖，从而影响学习记忆^[10]。在成年雄鼠，过度活化的mTOR可破坏神经元的形态，使树突棘的密度减少，损害空间记忆功能^[11]。

本研究通过Morris水迷宫实验发现：各浓度组雌雄小鼠第5d逃避潜伏期较第1天明显缩短；与对照组相比，25 %乙醇组雄鼠及50 %乙醇组雌雄小鼠有效区停留距离明显减少。这表明：各组小鼠虽然都具有一定的学习能力，但25 %乙醇慢性染毒对雄鼠的空间记忆能力有损伤，50 %乙醇慢性染毒对雄雌鼠空间记忆能力均有损伤。通过Western blot方法进一步研究发现：50 %乙醇组雄鼠海马结构内p-Akt，p-mTOR蛋白表达均较对照组明显升高，而雌鼠无显著性差异。这表明：50 %乙醇慢性染毒对雄鼠学习记忆的影响可能与海马内mTOR通路蛋白表达的变化有关。Liu^[12]等对大鼠神经元PC12细胞进行乙醇染毒发现：乙醇染毒组的细胞活性降低与p-Akt水平升高相关。此外，对小鼠NG108-15细胞进行乙醇染毒研究发现：乙醇可增加此细胞p-AKT蛋白的表达水平，并诱导mTOR信号通路的激活^[13]。慢性乙醇暴露导致脑内mTOR通路磷酸化水平上调，可能引起自噬溶酶体系统受到抑制^[14]，而抑制自噬可加重乙醇诱导的神经元损伤^[15]。

不同摄入乙醇方式及不同乙醇浓度对机体造成的影响具有性别差异^{[16 – 17]}。小鼠自由饮用乙醇的条件下，雌鼠饮用乙醇后的运动活性及对乙醇的耐受力较雄鼠强^[18]。Cozzoli等发现^[19]：在慢性乙醇中毒的小鼠中，mTOR抑制剂能通过mTOR信号通路使雄鼠的伏隔核内的乙醇浓度降低，但对雌鼠无作用。本研究发现：50 %乙醇组雌鼠比同浓度组雄鼠有效区停留距离长；50 %乙醇组雄鼠海马结构内p-Akt，p-mTOR蛋白表达的变化与雌鼠不同。提示慢性乙醇中毒引起雌雄小鼠学习记忆下降的程度不同，且海马内mTOR信号通路相关蛋白的变化存在性别差异。

综上所述，慢性乙醇中毒对学习记忆的影响存在性别差异，mTOR信号通路可能参与此过程。学习记忆相关机制复杂，至于何种因素通过何种途径导致雌鼠海马内mTOR信号通路相应蛋白变化不明显，有待于进一步研究。