近年来呼吸系统疾病的患病率逐渐增高，咳嗽、咳痰、喘是呼吸系统疾病的常见症状，可单独出现也可同时并存^{[1 – 2]}。咳嗽是机体的一种防御反射，通过咳嗽来清除呼吸道内的分泌物及有害因子，咳嗽可由多种因素引起^{[3 – 4]}，是协助诊断呼吸系统疾病的一个重要症状^{[5 – 6]}。痰是一种病理产物，在气管、支气管、肺泡发生炎症时，呼吸道黏膜的黏液腺分泌黏液增多而形成^[7]。痰液刺激呼吸道粘膜时可引起咳嗽，当痰液过度分泌、气道高反应性收缩、过敏、气道炎症等可引起哮喘的发生，严重的患者会导致呼吸抑制或窒息出现，危及患者生命^[8]。咳必停（KBT）为沈阳药科大学分析教研室提供，其主要成分为白芥子、紫苏子和莱菔子。三者均为治疗呼吸系统疾病的有效成分，其三种成分合用在中药古方中称为“三子养亲汤”，现将其进行古方开发，对咳必停进行相关的实验研究，观察其疗效。现将咳必停对小鼠及豚鼠镇咳、祛痰、平喘的实验结果报告如下。

实验药品咳必停（KBT），含量为2 g生药/g，沈阳药科大学分析教研室提供，批号：20160321；桂龙咳喘宁（GLKCN），山西桂龙医药有限公司生产，含量为1 g生药/0.3g，批号：20160510，用时以蒸馏水配制。实验动物为昆明种小白鼠，由沈阳药科大学动物室提供。合格证号：SCXK（辽）2016–008；豚鼠，由沈阳药科大学动物室提供。合格证号：SCXK（辽）2016–008

试验前取豚鼠若干只，放入4 L玻璃钟罩内用Gsc-A型雾化治疗机将17.5 %枸橼酸向钟罩内喷雾15 s，记录5 min内豚鼠的咳嗽次数，5 min内咳嗽次数少于10次者弃除。取合格豚鼠90只，随机分组，每组10只，共9组。各水平配方见表1。各组动物按1 mL/100 g灌胃给药（4.2 g/kg水煎剂）。灌胃前一夜禁食，只供给饮水，给药30 min后，将动物放入4 L玻璃钟罩内，用Gsc-A型雾化治疗机将17.5 %枸橼酸向钟罩内喷雾15 s，记录5 min内豚鼠的咳嗽次数和咳嗽潜伏期，咳嗽潜伏期是指喷雾开始时间至发生咳嗽所需的秒数，豚鼠咳嗽声音响亮，应以听到咳嗽声为准。

表 1

表 1 咳必停因素水平表 因素 A白芥子（g） B紫苏子（g） C莱菔子（g） 1水平 9 9 9 2水平 6 7 6 3水平 3 5 3

表 1 咳必停因素水平表

取昆明种小白鼠50只，体重20～25 g，雄性，随机分组，每组10只，共5组，即空白对照组，咳必停6.72、13.44、26.88 g生药/kg组和桂龙咳喘宁1.17 g生药/kg组。实验前一天饥饿过夜，只供给饮水。每只动物i.g.0.4 mL/20 g，各组动物采用不同浓度同体积药物，空白对照组给予等量溶媒。给药30 min后，各组动物按500 mg/kgi.p.5 %酚红溶液（以生理盐水配制）。注射后30 min处死动物，背位固定，分离气管。气管上切一小口，插入连接有2 mL注射器的塑料套管，以1 mL生理盐水冲洗气道30 min。将冲洗液吸入试管内，加0.1 mL 1 mol/L NaOH，使冲洗液呈碱性。用分光光度计波长546 nm处读出光密度，与酚红标准曲线比较，折算酚红量，比较给药组与对照组、给药组与给药组的气道排出酚红量。

取昆明种小白鼠50只，体重18～22 g，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，即空白对照组，咳必停6.72、13.44、26.88 g生药/kg组和桂龙咳喘宁1.17 g生药/kg组。每只小鼠i.g.0.4 mL/20g，各组动物采用不同浓度同体积药物，空白对照组给同体积蒸馏水。灌胃前一天饥饿过夜，只供给饮水，给药30 min后，将小鼠置于500 mL玻璃罩内，用Gsc-A型雾化治疗机将30 %氨水喷入钟罩内，喷雾5 s后，观察和记录小鼠咳嗽潜伏期和2 min内咳嗽次数。咳嗽潜伏期是指喷氨水雾开始时间至发生咳嗽所需的秒数。小鼠咳嗽表现为腹肌收缩，抬头，同时张大嘴一次为准。给药组与空白对照组进行比较，给药组之间进行比较。

试验前取豚鼠若干只，放入4 L玻璃钟罩内用Gsc-A型雾化治疗机将17.5 %枸橼酸向钟罩内喷雾15 s，记录5 min内豚鼠的咳嗽次数，5 min内咳嗽次数少于10次者弃除。取合格的豚鼠40只，随机分成5组，即空白对照组，桂龙咳喘宁0.72 g生药/kg组，咳必停16、8、4 g生药/kg组。咳必停、桂龙咳喘宁均用蒸馏水配置。每只动物按1 mL/100 g灌胃给药，各组动物采用同体积不同浓度，空白对照组给予等量蒸馏水，灌胃前一夜禁食，只供给饮水，给药30 min后，将动物放入4 L玻璃钟罩内，用Gsc-A型雾化治疗机将17.5 %枸橼酸向钟罩内喷雾15 s，记录5 min内豚鼠的咳嗽次数和咳嗽潜伏期，咳嗽潜伏期是指喷雾开始时间至发生咳嗽所需的秒数，豚鼠咳嗽声音响亮，应以听到咳嗽声为准。给药组与对照组之间进行比较。

试验前一天取豚鼠若干只，放入4 L玻璃钟罩内，用Gsc-A型雾化治疗机将2 %氯化乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）和0.1 % 磷酸组胺（histamine, His）按等容积混合的混合液，喷雾15s，记录每只豚鼠出现抽搐跌倒反应的引喘潜伏期，引喘潜伏期超过120 s的豚鼠不予选用。次日，取预选合格的豚鼠40只，随机分成4组，每组10只，即空白对照组，咳必停4、8、16 g生药/kg组，桂龙咳喘宁0.72 g生药/kg组，每只豚鼠按2 mL/100 g灌胃给药，各组动物采用同体积不同浓度，灌胃前一天饥饿过夜，只供给饮水，给药30 min后，将豚鼠放入4 L玻璃钟罩内，用Gsc-A型雾化治疗机将2 %氯化乙酰胆碱（Ach）和0.1 %磷酸组胺（His）按等容积混合的混合液，喷雾15 s，记录每只豚鼠出现抽搐跌倒反应的引喘潜伏期。给药组与对照组，各给药组间进行比较。

实验数据以 $\bar x \pm s$ 表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，组间比较用t–检验。

结果表明，最佳组合为因素A1水平、因素B1水平、因素C2水平。

表 2

表 2 咳必停正交设计结果表L9（33）n = 6 组合号 组合情况 平均镇咳率（%） 方差（S，%） A B C 1 1 1 1 56.17 9.58 2 1 2 2 58.50 8.12 3 1 3 3 41.00 4.43 4 2 1 2 69.17 9.99 5 2 2 3 33.17 7.98 6 2 3 1 37.33 9.54 7 3 1 3 16.83 10.30 8 3 2 1 15.50 6.95 9 3 3 2 23.17 4.92 1水平之和 155.7 142.2 109.0 2水平之和 139.7 107.2 150.8 3水平之和 55.5 101.5 91.0 最大差值 100.2 40.7 59.8

表 2 咳必停正交设计结果表L9（33）n = 6

根据实验得出空白对照组小鼠的酚红排出浓度为（0.328 9 ± 0.091 5）μg/mL，咳必停低（6.72 g/kg）中（13.44 g/kg）高（26.88 g/kg）剂量组酚红排出浓度分别为（0.624 0 ± 0.187 6）、（0.831 0 ± 0.355 9）、（0.853 5 ± 0.355 9）μg/mL，阳性对照药桂龙咳喘宁的酚红排出浓度为（0.515 4 ± 0.175 5）μg/mL。酚红标准曲线为A = 130.2 × 10^–3C + 6.074 × 10^–3，与空白对照组相比较，咳必停高、中、低剂量组酚红排出量明显增多（P < 0.01），且呈剂量效应关系，其中剂量作用强于阳性对照药（ P < 0.05），高剂量组与阳性对照药比较作用明显（ P < 0.01）。

根据实验得出空白对照组小鼠咳嗽潜伏期为（42.3 ± 9.3）s，咳嗽次数为（30.3 ± 5.4），咳必停低（6.72 g/kg）中（13.44 g/kg）高（26.88g/kg）剂量组的咳嗽潜伏期分别为（58.6 ± 12.6）、（65.2 ± 14.2）、（68.7 ± 18.7）s，咳嗽次数分别为（16.6 ± 4.6）、（8.1 ± 1.8）、（6.2 ± 2.1），阳性对照药桂龙咳喘宁的咳嗽潜伏期为（43.7 ± 12.9）s，咳嗽次数为（14.7 ± 4.5）。与空白对照组相比较，咳必停高、中、低组小鼠的咳嗽潜伏期明显延长（P < 0.01），咳嗽次数明显减少（ P < 0.01），呈一定的剂量效应关系，咳必停中、高剂量组镇咳作用明显强于阳性对照药桂龙咳喘宁组（ P < 0.01）。

根据实验得出空白对照组给药前后豚鼠咳嗽潜伏期分别为（65.5 ± 21.1）、（69.1 ± 28.0）s，给药前后咳嗽次数分别为（25.2 ± 10.6）、（21.9 ± 5.4），咳必停低、中、高剂量组给药前的咳嗽潜伏期分别为（43.8 ± 25.7）、（42.5 ± 21.2）、（39.0 ±12.1）s，给药后分别为（74.7 ± 59.7）、（76.4 ± 37.6）、（87.3 ± 54.6）s，给药前的咳嗽次数分别为（25.2 ± 5.3）、（27.8 ± 9.7）、（21.8 ±10.2），给药后为（13.3 ± 4.3）、（16.0 ± 6.8）、（11.1 ± 4.9），阳性对照药桂龙咳喘宁给药前的咳嗽潜伏期为（59.5 ± 27.2）s，给药后为（125.6 ± 70.9）s，给药前咳嗽次数为（23.7 ± 9.2），给药后为（7.6 ± 5.5）。与空白对照组相比较，咳必停对豚鼠咳嗽潜伏期的延长有一定作用，且呈一定的剂量效应关系，咳必停低、高剂量组的咳嗽次数明显减少（P < 0.01），中剂量组作用稍弱（ P < 0.05）。

根据实验得出空白对照组给药前后豚鼠引喘潜伏期分别为（62.00 ± 7.96）、（63.9 ± 7.81）s，咳必停低（4 g/kg）中（8 g/kg）高（16 g/kg）剂量组给药前的引喘潜伏期分别为（79.67 ± 17.19）、（79.83 ± 25.21）、（62.83 ± 15.09）s，给药后分别为（91.00 ± 16.65）、（360.00 ± 0.00）、（153.85 ± 108.07）s，阳性对照药桂龙咳喘宁给药前的引喘潜伏期为（77.33 ± 15.79）s，给药后为（149.83 ± 103.86）s。咳必停各剂量组对豚鼠的引喘潜伏期明显延长，与空白对照组差异有统计学意义（P < 0.01），中剂量组与阳性对照药差异有统计学意义（ P < 0.01）。

白芥子主痰，具有温肺化痰、利气散结的作用，炒白芥子醇提取物有镇咳作用，白芥子水提取物有祛痰作用，炒白芥子的石油醚提取物有平喘作用，白芥子可用于治疗痰饮咳喘等^[9]；紫苏子主气喘咳嗽，具有降气行痰、止咳平喘、润肠的作用，常用于痰雍气逆，咳嗽气喘，肠燥便秘^[10]，其水提取物、醇提取物及醚提取物均有镇咳作用，水提取物有祛痰作用，炒紫苏子的对提取物及醚提取物有平喘作用^[11]；莱菔子主食痞兼痰，具有消食导滞、行气祛痰的作用，可用于饮食停滞、大便秘结、脘腹胀痛、痰雍喘咳、积滞泻痢^[12]，大剂量炒莱菔子醚提取物和生莱菔子的醇提取物有较强的镇咳作用，生莱菔子醇提取物有祛痰作用，炒莱菔子水提取物有平喘作用^[13]。古方中三者合用为“三子养亲汤”，方源《韩氏医通》，具有止咳平喘、降气行痰、消食导滞的作用，主要用于治疗痰雍气逆食滞等症，临床常用于治疗咳嗽、慢性支气管炎、小儿喘息性肺炎等^[14]。本实验将中药古方进行再开发，制成颗粒剂，便于患者服用，三者按照最佳剂量组合，协同发挥作用。

正交试验设计是研究多因素水平的一种试验设计方法，能够高效、快速、经济的检测出药物的最佳剂量组合^[15]。本实验根据正交试验设计结果得出白芥子，紫苏子，莱菔子三味药的最佳组合比例为9:9:6，对三味药最优配伍能够增强药效，发挥作用。本研究分别对咳必停高、中、低剂量作了小鼠酚红排出量、小鼠氨水引咳、豚鼠枸橼酸引咳及豚鼠组胺和乙酰胆碱引喘实验，发现咳必停高、中、低剂量组均有镇咳、祛痰、平喘作用。随着咳必停用药剂量的增加，对小鼠的祛痰作用及镇咳作用均增加，呈现一定的剂量效应关系；咳必停高剂量与低剂量对豚鼠的镇咳作用强，中剂量稍弱；咳必停对豚鼠有明显的平喘作用，其中中剂量作用最为明显。