随着检测技术的发展和人们生活质量的提高，由真菌毒素导致的农畜产品安全问题引发全球关注。真菌毒素是真菌生长代谢过程中产生的具有毒性的次级代谢产物，主要的真菌毒素包括：黄曲霉毒素（aflatoxins, AFs）、赭曲毒素（ochratoxin, OTA）、伏马毒素（fumonisin, FB）、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）、展青毒素（patulin, PAT）、桔青霉素（citrinin, CIT）、T-2毒素（T-2 Toxin, T2）、麦角碱（ergotalk aloids）、交链孢酚（alternaria toxins）等^[1]。真菌毒素具有细胞毒性、免疫毒性、神经毒性和生殖毒性，甚至致癌性，国际癌症研究所（International Agency for Research on Cancer ，IARC）将致癌物质分为4个级别（1, 2A, 2B, 3, 4），其中AFs是1级致癌物质，FB1、OTA均为2B级致癌物质，PAT、CTT、ZEN、DON均为3级致癌物^[2]。真菌毒素可广泛污染谷物类食品、动物饲料、奶制品等，造成的经济损失大，对人和动物的危害性强，因此真菌毒素的检测与监控显得尤为重要。

1 真菌毒素的常规检测方法

目前，真菌毒素的常规检测方法主要包括基于仪器分析的色谱分析方法和基于免疫反应的免疫化学分析方法两大类^[3]。

1.1 仪器分析方法

真菌毒素的仪器分析方法主要包括荧光光度法（fluorospectrophotometry, FS）、薄层色谱法（thin layer chromatography, TLC）、气相色谱法（gas chromatography, GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）、超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography, UPLC）、色谱与质谱联用法等^[3]；其中，色谱质谱联用法常见于气相色谱–质谱法（gas chromatography-mass spectrography, GC-MS）、高效液相色谱–质谱法（HPLC-MS）、超高效液相色谱–质谱法（UPLC-MS）、气相色谱–串联质谱法（GC-MS/MS）、液相色谱–串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）、高效液相色谱–串联质谱（HPLC-MS/MS）、超高效液相色谱–串联质谱法（UPLC-MS/MS）、液相色谱–飞行时间质谱联用法（liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry, LC-TOF-MS）等^[4]；这些分析方法测定精确，但样品前处理相对复杂，仪器成本高，造成检测成本高，对操作人员的技术要求高，不适于基层大量样本的高通量检测，不能满足快速高效的检测方法的要求^[5]。

1.2 免疫化学分析方法

基于免疫化学的检测方法具有高灵敏度、高特异性等特点，是真菌毒素的常规检测方法之一，目前在真菌毒素快速检测方面占据主要地位，主要包括酶联免疫吸附法、荧光免疫分析法、新型化学发光免疫分析法、电化学生物传感器法等。免疫化学分析方法主要是基于抗原–抗体反应，虽然在不同层面解决了仪器分析方法的弊端，但是真菌毒素作为小分子半抗原，表面的抗原决定簇比较单一，这给免疫化学分析方法带来新的难题：一方面，针对真菌毒素的抗体制备比较复杂、耗时，且抗体的结构稳定性比较容易受到外界环境的影响；另一方面，基于免疫化学分析的真菌毒素检测过程会涉及到毒素或抗体的固定，这也在一定程度影响抗体的生物活性。抗体自身的问题在很大程度上限制了免疫化学分析方法的发展应用，于是人们试图寻找抗体替代物，基于核酸适配体的真菌毒素检测方法随之发展起来。

2 基于核酸适配体的真菌毒素检测方法 2.1 核酸适配体简介（表1）

1990年，Tuerk^[6]在Science上首次提出指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）的概念，同年，Ellington^[7]在Nature上将用SELEX技术筛选到的寡核苷酸序列命名为核酸适配体（aptamer）。核酸适配体的结构多样，易于形成发卡、假结、凸环、G–四联体等复杂的空间结构，与靶标发生类似抗原–抗体反应的构象识别。既有类似抗体的功能，又可模拟真菌毒素，前者可替代毒素抗体，后者可以在真菌毒素检测中用来替代真菌毒素，实现环保检测；而且相较于抗体而言，在亲和力高、特异性强的基础上还具有靶标范围广、筛选周期短、分子量小、免疫原性低、不依赖动物、低成本、易重复、稳定性好、便于合成和修饰等优点^[8]。核酸适配体以其类似抗体、又可模拟靶标物质的特点而具有很大的发展潜力。SELEX技术的发展促使形式多样的核酸适配体被筛选出来；目前，已有很多真菌毒素核酸适配体的相关报道，本文将国内外文献中几种常见真菌毒素的核酸适配体序列信息总结于表1。

2.2 核酸适配体模拟毒素抗体应用

核酸适配体的功能类似抗体同时又具有诸多优于抗体的特点，这些特性较好的回避了基于抗体的免疫化学分析方法的不足，使得核酸适配体取代抗体成为真菌毒素检测领域中备受瞩目的新型分子识别元件；目前，基于核酸适配体的检测方法常见于形式多样的传感器系统，利用核酸适配体搭配不同的信号放大手段即可实现对相应毒素的快速检测，比较常见的传感器系统包括比色传感器、化学发光传感器、荧光传感器、表面等离子共振传感器、表面增强拉普拉曼传感器、电化学传感器、压电晶体传感器等^[23]，本文针对上述传感器系统做具体介绍。

2.2.1 比色传感器

纳米材料的表观颜色可随纳米微粒表面性质的改变而发生相应的变化，比色传感器可以根据核酸适配体与靶标作用前后，溶液的颜色变化来达到检测的目的。Yang等^[23]利用OTA核酸适配体和未经修饰的金纳米颗粒组建了检测OTA的比色传感器，当OTA不存在的时候，OTA核酸适配体可以容易地吸附到金纳米颗粒的表面，从而维持金纳米颗粒对盐诱导聚集的稳定性，溶液颜色为红色；加入OTA之后，OTA核酸适配体会迅速发生构象改变来与之结合，导致金纳米颗粒发生聚集，溶液由红色变成蓝色，因而可以通过肉眼监测溶液颜色的变化来实现检测。

2.2.2 化学发光传感器

化学发光传感主要是利用物质在进行化学反应过程中伴随的光辐射现象来达到检测目的^[22]，较为常见的是借助DNA酶催化鲁米诺与H₂O₂的反应。Shim等^[25]利用核酸适配体替代酶联抗体，采用竞争法检测AFB1，具体做法是在AFB1核酸适配体的末端连接一段类过氧化物酶的DNA序列，加入的AFB1会竞争性的与该AFB1核酸适配体结合，而固定在96孔板上的AFB1-卵蛋白便失去了与AFB1核酸适配体结合的机会，此时再加入H₂O₂ 和鲁米诺后便不会出现化学发光现象。利用该法可以实现对AFB1的定量检测，检出限为0.11 ng/mL，同酶联抗体相比，检出限大大降低。

2.2.3 荧光传感器

荧光传感器可以利用荧光基团标记核酸适配体或者在系统中引入荧光或淬灭基团，通过测定体系在靶标与核酸适配体作用前后荧光强度或荧光偏振的变化来进行检测^[22]。Chen等^[25]利用荧光标记的AFB1核酸适配体与含有淬灭基团的部分互补DNA链组成DNA/DNA双链体，AFB1不存在时，AFB1核酸适配体与cDNA结合，荧光基团和淬灭基团因充分接近而发生荧光猝灭，引入AFB1后，荧光标记的AFB1核酸适配体与AFB1结合而释放含淬灭基团的cDNA，体系荧光强度随之增强，该法对AFB1的检出限为1.6 ng/mL。Joo等^[26]以氧化石墨烯为平台搭建了AFB1快速检测的荧光传感器，将荧光染料标记的AFB1核酸适配体作为分子识别探针加入到氧化石墨烯之后，荧光探针会吸附到氧化石墨烯的表面导致荧光淬灭，加入AFB1后，AFB1核酸适配体与之结合导致荧光信号的恢复，根据荧光信号的强弱实现对AFB1的定量检测，检出限为4.5 ng/mL。

2.2.4 表面等离子共振传感器

局部表面等离子共振是金纳米粒子和银纳米粒子最显着的特征之一^[27]，将核酸适配体修饰到离子共振装置的表面，通过靶标与核酸适配体互作引起的离子共振装置折射率的改变来进行检测。Park等^[28]将OTA的核酸适配体固定在玻璃表面的金纳米棒上，加入不同浓度的OTA之后，金纳米棒表面折射率的变化使得LSPR的峰出现不同程度的红移，该法对OTA的检出限为1nmol。

2.2.5 表面增强拉普拉曼传感器

表面增强拉普拉曼传感器通常是将核酸适配体吸附在诸如金属或纳米粒子等粗糙表面上，通过光子与拉曼分子碰撞发生的方向与能量的改变来达到检测的目的。Li等^[29]利用表面增强的拉普拉曼传感器实现了对AFB1的快速检测，具体做法是以金纳米颗粒作为核心，当AFB1不存在时，被AFB1核酸适配体和拉曼标签（ATP）修饰的银纳米颗粒聚集环绕在金核的周围，此时表面增强的拉普拉曼信号增强，加入AFB1之后，银纳米颗粒上的核酸适配体与AFB1结合，银纳米颗粒离开金核而分散开来，表面增强的拉普拉曼信号随之减弱，该法对AFB1的检出限为0.48 pg/mL。

2.2.6 电化学传感器

电化学传感器主要是将核酸适配体固定在电极或电化学活性传感元件上，通过检测电流、电阻或电势等的变化来定性或定量检测靶物质。Shi等^[30]利用金纳米粒子和石墨烯/硫蛋白纳米复合物的双重放大作用实现对FB1的快速检测，具体做法是将金纳米颗粒固定到电极表面以增强电导率，然后通过捕获核酸将FB1的核酸适配体固定到电极表面，此时FB1核酸适配体的单链部分会和石墨烯/硫蛋白的纳米复合物之间通过 π-π 键的共轭作用实现电化学信号的放大，加入FB1后，FB1核酸适配体与之结合而将石墨烯/硫蛋白的纳米复合物释放，导致电化学信号的降低，通过电化学信号的变化可实现对FB1的检测，检出限为1 pg/mL。

2.2.7 其他传感器系统

基于核酸适配体的传感器系统不仅可以实现对某种特定毒素的检测，也可用于多种真菌毒素的同时检测，这也更加符合实际需求。Wu等^[31]利用基于多重荧光共振能量转移的传感器系统实现了对OTA、FB₁两种真菌毒素的检测，将OTA和FB₁的核酸适配体分别连接到掺铒（erbium, Er）和掺铥（thulium, Tm）的上转换荧光纳米颗粒的表面，当被检物不存在时，上转化荧光纳米颗粒上面的ssDNA与氧化石墨烯之间通过 π-π 共轭结合，导致荧光淬灭；加入OTA和FB₁之后，上转换荧光纳米颗粒表面的核酸适配体与靶标特异性结合而从氧化石墨烯上面释放出来，荧光信号增强。该法背景值低，淬灭效果好，OTA和FB₁的检出限分别为0.02 ng/mL和0.1 ng/mL。

2.3 核酸适配体模拟真菌毒素应用（图1）

核酸适配体除了能够模拟并取代抗体应用到形式多样的传感器系统中实现真菌毒素的检测，还能以毒素单抗为靶标筛选能模拟真菌毒素表位的核酸适配体，使之成为安全、环保的真菌毒素替代品。如图1所示，Wang等^[32]筛选到了针对玉米赤霉烯酮单克隆抗体的46号核酸适配体，并利用46号核酸适配体作为真菌毒素玉米赤霉烯酮的替代物，初步建立竞争型ELOSA检测玉米赤霉烯酮的方法。除了可利用核酸适配体替代真菌毒素，实现单一真菌毒素的无毒检测，还可将不同的真菌毒素替代物进行嵌合，获得多功能核酸适配体，建立多元化、高通量、通用型的无毒环保真菌毒素检测平台。

3 结　语

虽然核酸适配体可用于真菌毒素的检测，但目前还存在一些不足：（1）核酸适配体的筛选目前还是制约其应用的原因之一，如何真正突破筛选瓶颈，建立低成本，适用范围广泛的核酸适配体筛选方法或平台，筛选出更多高效稳定的核酸适配体是目前亟待解决的问题；（2）目前针对真菌毒素的有效的核酸适配体数量有限，处于理论研究的居多，且针对多种真菌毒素的检测元件的研究还略显不足应该适当加强商品化核酸适配体的研制与应用，关注复杂基质中真菌毒素的快速高效检测；（3）建立基于核酸适配体的低毒乃至无毒的环保型真菌毒素检测体系，是未来真菌毒素等小分子有毒有害物质监测领域的需求和发展方向之一，应适当加强模拟真菌毒素表位的核酸适配体的研究，找出更多的真菌毒素替代品，使得真菌毒素检测快捷高效的同时更加的环保安全。综上所述，虽然基于核酸适配体的真菌毒素检测方法还有很多不成熟的地方，但核酸适配体本身发展潜力巨大，相信随着科技的进步，他会为真菌毒素的监测与控制提供更多强有力的支撑。