2018, Vol. 34
2. 南昌市疾病预防控制中心公共卫生监测所
双酚A（bisphenol A, BPA）是近几年从食品包装材料中新发现的一种环境“内分泌干扰物质”[1]。其学名为2,2–二（4–羟基苯基）丙烷，分子式为C15H16O2，分子量228.29，白色针状晶体，主要用作生产环氧树脂和聚碳酸酯等塑料的中间体[2]。目前，国内外常用的检测双酚A的方法主要有气相色谱（gas chromatography，GC）法[3]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[4 – 5]法、酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法[6]、酶生物传感器法和光免疫传感器法[7]等。色谱分析法检测限可达4～6 ng/L[8]，但样品前处理复杂，操作耗时，不适合大量样品的现场检测。基于抗原抗体特异性反应的ELISA方法操作简便、快速且具有较高的灵敏度，符合现场双酚A污染的痕量检测需求。本研究于2014年采集南昌市近郊儿童人群血清，建立间接竞争ELISA法检测BPA水平。
1.1 主要仪器与试剂BPA标准品（纯度≥99 % ）和羊抗鼠酶标二抗（美国Sigma公司）；乙腈（色谱纯）（西陇化工股份有限公司）；N,N–二甲基甲酰胺（分析纯）（天津市大茂化学试剂厂）；四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）（上海生工生物工程有限公司）；抗BPA单克隆抗体检测抗原[9]（江西科技师范大学生命科学学院实验室自制）。包被液：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4）；封闭液：0.05 g/mL脱脂奶；洗涤液：含0.05 % （v : v）吐温–20（Tween-20））的PBS即PBST；标准品稀释液：超纯水。标准溶液的配制：精密称取BPA标准品50 mg，置于50 mL容量瓶中，用二甲基甲酰胺（dimethyl Formamide，DMF）定容得到浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，分析前用超纯水稀释成系列不同浓度的标准工作溶液。Multiskan MK3酶标仪、WELLWASH VERSA洗板机（美国Thermo公司）；5804R型离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；96孔酶标板（美国Costar公司）。
1.2 对象2014年在南昌市近郊的一次儿童体检中，遵从儿童及其父母知情同意并自愿的原则，选取3所小学8～10岁共176名儿童作为研究对象。取静脉血4 mL至洁净的玻璃试管中（在操作过程中未使用塑料管，因塑料管可能有BPA溶出），离心后，血清置于 – 20 ℃冰箱中保存。
1.3 方法 1.3.1 间接竞争ELISA建立用PBS将BPA检测抗原稀释至1 μg/mL包被在96孔酶标板上，120 μL/孔，4 ℃包被过夜；用PBST洗板4次，每孔加入320 μL 0.05 g/mL的脱脂奶在37 ℃温育2 h；洗板4次，加入超纯水稀释的BPA标准品50 μL和50 μL的合适稀释比的抗体稀释液，37 ℃温育40 min；洗板4次，每孔加入100 μL 1:2 500的酶标二抗，37 ℃温育40 min；洗板4次，加入TMB显色液100 μL/孔，避光显色8 min；取出每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪测定450 nm处的吸光值OD450。每个浓度测定3次，取平均值。计算结合率（结合率 = B/B0 × 100 % ，B0为不加BPA的OD450值，B为加BPA的OD450值），并以10倍的BPA标准品浓度的对数为横坐标，结合率为纵坐标，绘制标准曲线。并选择抑制率为10 % 所对应的浓度为最低检测限。
1.3.2 提取方法建立（1）乙醚萃取提取法 吸取0. 5 mL系列不同质量浓度的BPA血清加标液，分别加入3 mL乙醚萃取，旋涡振荡3 min，静置1 min，分离出乙醚层，再加入2 mL乙醚萃取，合并2次萃取的乙醚，室温下用氮气（N2）吹干，残留物加500 μL超纯水溶解。采用间接竞争ELISA法进行测定，计算回收率。（2）三氯乙酸沉淀蛋白提取法 吸取0.5 mL血清加标液，加入150 μL 10 % 的三氯乙酸，旋涡振荡，4 ℃，10 000 r/min离心20 min。取上清，调节pH至7.4，采用间接竞争ELISA法进行测定，计算回收率。（3）乙腈沉淀蛋白提取法[10]吸取0.5 mL血清加标液，加入1.5mL乙腈，震荡摇匀，40 ℃静置30 min，取出混合液于4 ℃，10 000 r/min离心20 min，收集上清。再加入1 mL乙腈于沉淀中，混合振荡，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，收集上清。合并两次上清于洁净的10 mL玻璃试管中，室温下用N2吹干，残留物加500 μL超纯水溶解。采用间接竞争ELISA法进行测定，计算回收率。
1.3.3 血清BPA回收率测定（1）血清中BPA加标回收率测定 以胎牛血清为加标样品。用超纯水配制质量浓度为100 ng/mL的BPA加标溶液。分别吸取BPA加标溶液（100 ng/mL）1.25、2.5、5、12.5 mL于25 mL容量瓶中，加入胎牛血清定容，混合摇匀，得到一系列不同质量浓度的BPA加标溶液，分别吸取0.5 mL加标定容后的血清，按照1.3.2优化的方法进行处理后，再分别按照间接竞争ELISA法进行测定，每个浓度平行测定4次，计算加标回收率。（2）样品中BPA的含量检测 取出保存在–20℃的血清于室温下解冻并摇匀，取0.5 mL于5 mL具塞玻璃试管中，按照提取方法（3）步骤进行血清的前处理。取处理好的176份样品，在线性范围内，按照间接竞争ELISA法测定，每个样品平行测定4次，取平均值，计算样品中BPA浓度。
1.4 统计分析使用SPSS 13.0分析数据。使用K-S检验确定样品中BPA浓度分布是否为正态分布。使用χ2检验确定不同年龄和性别间BPA检出率差异。使用秩和检验确定BPA浓度在不同性别和年龄组之间差异。
2 结 果 2.1 间接竞争ELISA标准曲线的建立（图1）以包被抗原浓度为1 μg/mL，抗体工作浓度为1 : 512 000，酶标二抗工作浓度为1 : 2 500为最佳的ELISA分析条件建立的间接ELISA标准曲线的线性范围为1～50 ng/mL，线性方程为y = – 0.339x + 1.116，R2 = 0.995，检测下限为0.43 ng/mL，50 % 抑制浓度（50 % inhibitory concentration，IC50）为6.56 ng/mL。
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图 1 ELISA间接竞争抑制曲线 |
2.2 提取方法选择（图2）
BPA微溶于水，溶于甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂。进行提取方法建立时，首先采用乙醚作为萃取剂与血清混合后进行萃取，提取血清中的BPA，萃取后的BPA的回收率为23.6 %～43.2 % 。采用三氟乙酸沉淀血清中蛋白质，测得BPA回收率为30.3 %～34.6 % 。换用乙腈作为提取溶剂，由于血清样品中蛋白质含量较高，在提取过程中要尽可能去除血清中的蛋白质，需对加入的乙腈的量进行优化，实验中发现，加入的乙腈体积为血清体积的3倍时，蛋白质沉淀较为完全。对提取时间和提取温度进行了优化，0.5 mL血清样品中加入1.5 mL乙腈40 ℃提取30 min，BPA的回收率 ≥ 70 %。
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图 2 不同提取方法的加标回收率 |
2.3 血清中BPA加标回收率测定（表1）
将添加有不同浓度的BPA标准品的血清样品，经乙腈沉淀蛋白提取后，用建立的间接竞争ELISA方法检测BPA含量，测得血清样品中BPA的回收率为70.1 % ～87.8 %，变异系数为4.79 % ～9.41 %。
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表 1 BPA加标回收率（
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2.4 样品的测定 2.4.1 儿童血清中BPA浓度分布（图3）
儿童血清经过处理后，进行间接竞争ELISA实验。使用SPSS 13.0 分析数据，K-S检验显示频数分布不服从正态分布。176份儿童血清，81份未检测出BPA，95份检测出含有BPA。全部血清样品中BPA浓度范围为未检出至26.48 ng/mL。95例检出者中BPA含量最低为0.44 ng/mL，最高为26.48 ng/mL。
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图 3 BPA浓度分布 |
2.4.2 不同年龄、性别儿童血清中BPA浓度及检出率情况（表2、3）
BPA浓度在不同年龄组之间存在一定的差异，但差异不明显（P = 0.195）。对全部样品的检出率进行分析，男童检出率高于女童。不同年龄组之间的检出率存在差异，但不明显（P = 0.16）。71例男童中，有44名检测出BPA，27名未检出。男童的年龄层次分析结果显示，不同年龄段的检出率之间差异不明显（P = 0.066）。105名女童中，有51名检出BPA，54名未检出。
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表 2 不同年龄BPA检出情况 |
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表 3 不同性别年龄BPA检出情况分析 |
3 讨 论
添加BPA的塑料制品具有无色透明、耐热、耐撞和轻巧等特性，广泛应用于婴儿奶瓶、水瓶、塑料餐具和食品包装材料等各种日用品中[11 – 14]。王丹[15]研究发现除塑料制品外，一些沐浴露、洗发露、护肤品中也含有BPA。2003年，世界BPA年生产总量已经超过200万吨，其需求率以每年6 %～10 % 的速率增长[16 – 17]。目前，不仅在空气、水、污水污泥、土壤和食品等环境样品中发现BPA，而且在人体体液样本如血液、尿液、唾液、羊水和母乳中也发现其残留[18 – 20]。动物实验和体外研究表明，BPA具有雌激素作用，它能模拟内源激素、雌激素和雄性激素影响人和动物的中枢神经系统和生殖系统[21]。郑劼等[22]研究发现BPA会降低雄性小鼠精子数量和活性，增加精子的畸形率。长期大量接触BPA，会对肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和肺等多个器官系统产生损害[23]。在中国从2011年6月1日起禁止生产含BPA的婴幼儿奶瓶，9月1日起，禁止进口和销售含BPA的婴幼儿奶瓶[24]。因此，为有效控制BPA对环境和人体的危害，快速有效的检测方法必不可少。
本研究利用实验室制备的抗BPA单克隆抗体3H1，建立了间接竞争ELISA方法测定人血清中BPA含量。检测范围为1～50 ng/mL，IC50为6.56 ng/mL，最低检测限为0.43 ng/mL。本次研究显示江西南昌地区儿童血清中有BPA残留，所有血清BPA浓度范围为未检出至26.48 ng/mL，个别含量较高，可能与长期的接触和累积有关，需密切关注其来源。为防止塑料制品中因BPA溶出污染样品，处理过程中尽量使用玻璃容器，且必须经过严格清洗。经实验发现，本研究中所用的酶标板对BPA的检测无影响。由于血清中的蛋白质含量较高，会与BPA发生疏水作用和氢键作用[25]，干扰ELISA的检测，所以在建立方法的过程中，选择了用乙腈沉淀蛋白质的方法提取血清中的BPA，降低了基质干扰，达到了较好的提取效果。研究表明，BPA在 > 60 ℃的温度下，氧化速度会明显加快。提取过程中，为使BPA能够快速溶解于乙腈，而又不发生氧化，选择了温度为40 ℃。
本文建立间接竞争ELISA法检测BPA，并获得了BPA在南昌地区儿童血液中的残留水平，为进一步的深入研究奠定了基础。下一步，将对血清中BPA含量较高的儿童进行调查，了解其所接触到的食品、食品包装物和环境污染物等。同时，对BPA的迁移规律进行深入研究，为人们提出宝贵的建议，保护人们的健康。
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