手足口病（hand, foot and mouth disease, HFMD）是由多种肠道病毒引起的儿童传染病，自1957年第1例手足口病患者在新西兰发现以来^[1]，包括美国，法国和丹麦等全球多个国家和地区均有相关病例报道^{[2 – 3]}。20世纪末，亚太地区国家如日本、韩国和新加坡等均出现过大规模的暴发与流行，中国2016年HFMD发病总数就达244余万，居丙类传染病首位^{[4 – 8]}。目前已知有20多种肠道病毒可引起HFMD，包括肠道病毒A组的肠道病毒71型（enterovirus 71, EV71），柯萨奇病毒（Coxsackie virus, CV）A16，A6和A10型，B组CV-B3，B5型和埃可病毒30型（echovirus 30, ECHO 30），C组的CV-22和24型等^[9]。2015年底，中国批准全球首个EV71灭活疫苗上市^{[10 – 11]}，对HFMD疫情的控制起了一定作用，但是EV71单价灭活疫苗对CV-A16和其他肠道病毒引起的HFMD没有交叉保护作用。随着HFMD的病原谱改变，HFMD多价疫苗是未来的发展方向。本文着重介绍近年来HFMD多价疫苗的研发进展，动物模型在疫苗研制中的应用及应用中存在的问题，为HFMD多价疫苗的研制提供参考。

肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CV-A16）是导致HFMD的主要病原体。由于已上市的3株EV71疫苗均为全灭活疫苗，且EV71病毒和CV-A16病毒的基因组序列相似性较大，借鉴EV71疫苗的成功研发经验，CV-A16单价灭活疫苗的研发也已进入临床申报阶段^[12]。中科院上海巴斯德研究所Cai等^[13]使用EV71/FY573株和CV-A16/G08株在Vero细胞基质中分别制备EV71和CV-A16单价疫苗，β–丙烯内酯灭活，氢氧化铝为佐剂，等量抗原混合的单价灭活疫苗即为EV71/CV-A16双价灭活疫苗，取各含1 μg EV71和CV-A16抗原的双价灭活疫苗免疫小鼠后发现能引起机体较好的免疫应答，产生对不同EV71和CV-A16病毒株的中和抗体滴度均在1 : 1 024以上，且免疫9周后中和抗体水平没有下降。被动免疫保护实验表明，中和抗体可完全保护乳鼠免受致命剂量EV71和CV-A16病毒的攻击，母传抗体的保护率也为100 %。EV71/CV-A16双价灭活疫苗诱导产生的免疫应答水平与EV71和CV-A16单价灭活疫苗相比，没有显著性差异，说明EV71/CV-A16双价灭活疫苗中2种抗原没有产生明显的抑制或者干扰现象，同时没有发现抗体依赖性增强作用，这为EV71/CV-A16双价全灭活疫苗的应用提供了依据。

Vero细胞由于是传代细胞，可能存在致瘤性；而二倍体细胞来源于人体，无外源蛋白过敏原，无致瘤性，因此受到疫苗研发人员青睐。吉林大学的Li等^[14]采用二倍体细胞MRC-5为细胞基质制备EV71/CV-A16双价灭活疫苗，同样没有在小鼠和恒河猴模型中发现EV71和CV-A16抗原相互抑制和干扰现象，该团队发现用无针头注射器皮下接种疫苗产生的免疫保护效果与经肌肉接种方式类似，由于HFMD疫苗的接种对象为5岁以下儿童，从人群接受度来讲，使用微创的无针头注射器皮下接种比经肌肉接种更易让婴幼儿及其家长接受。

VLP是只含有结构蛋白的病毒空心颗粒，由于保留了病毒的空间结构，具有较好的免疫原性，同时因无病毒基因组，不能自主复制，无感染风险，是一种理想的疫苗形式，目前在HPV （human papilloma virus）和乙肝等疫苗中均有应用^[15]。澳洲昆士兰大学的Somasundaram等和上海巴斯德研究所的Ku等^{[15 – 16]}利用昆虫杆状病毒表达体系（baculovirus expression vector system，BEVS）表达病毒的P1与3CD蛋白，制备EV71/CV-A16双价VLP疫苗。Ku等^[16]发现双价VLP疫苗在小鼠内有良好的免疫原性和免疫保护效果，同时与EV71/CV-A16双价灭活疫苗类似，VLP疫苗的双抗原并没有干扰现象。Somasundaram等^[15]发现宿主细胞Sf9表达的EV71和CV-A16 VLPs产量比Hi-5高，且低温培养（21 ℃）更利于产量提高；然而表达CV-A16 VLP棒状病毒的传代敏感性较强，病毒传5代后不表达CV-A16的结构蛋白，这是以后规模化生产需要解决的问题。Gong等^[17]通过晶体学分析发现，利用BEVS表达EV71和CV-A16VLPs的空间构象与天然病毒空壳颗粒类似，多种已验证的线性中和表位如EV71的SP55、SP70和VP1-43，CV-A16的PEP32、PEP37、PEP55、PEP71和PEP91，EV71和CV-A16的交叉中和表位VP2-28等均位于VLP的表面，VLP疫苗免疫小鼠后产生的中和抗体滴度可达1 : 320以上，从晶体结构水平为双价VLP疫苗的应用提供理论基础。

厦门大学Xu等^[18]使用乙肝病毒核心蛋白（hepatitis B viral core protein, HBc）作为载体表达EV71病毒的VP1（aa208-222）和VP2（aa141-155）中和表位，发现此嵌合VLP疫苗可诱导产生对EV71和CV-A16病毒的中和抗体，并且在被动保护实验中100 %保护乳鼠，显示了嵌合VLP疫苗在广谱HFMD疫苗研制中的应用潜力。上海巴斯德研究所Zhang等^[19]使用Hexon区改造的腺病毒载体AdC68制备HFMD双价VLP疫苗，将CV-A16的中和表位PEP71和EV71的中和表位sSP70分别嵌入AdC68 载体的HVR1 和HVR2区，结果发现，这2个中和表位均能很好地表达在病毒颗粒表面，AdC68 载体表达的双价VLP疫苗可诱导小鼠产生中和抗体，并且能很好保护乳鼠免受CV-A16和EV71病毒的攻击。腺病毒载体是生产疫苗的常见载体，而将抗原表达在腺病毒载体AdC68的Hexon区则是全新的策略，目前研究也表明Hexon区改造后的AdC68载体不能被野生型AdC68诱导的中和抗体结合，其不同的免疫原性也显示了改造后的AdC68载体在HFMD疫苗研制中的潜力。

目前，非EV71和非CV-A16感染所致HFMD的比例在上升，其中以CA6和CA10上升最为明显，2010年法国^[2]、2011 — 2012年西班牙 ^[20]和2012年印度^[21] HFMD疫情的主要病原体为CA6和CA10，在我国的广东，武汉和苏州等地区^{[22 – 23]}CA6和CA10也逐渐成为导致HFMD的主要病原体，因此研制HFMD三价及多价疫苗应首先考虑预防CA6和CA10病毒。美国威斯康星大学的Caine等^[24]用Vero细胞基质分别制备EV71、CV-A16和CA6单价灭活疫苗，灭活剂为二乙烯亚胺，将3个各含1.5 μg的单价灭活疫苗混合即为EV71/CV-A16/CA6三价灭活疫苗。三价灭活疫苗免疫小鼠后血清中和抗体效价均在1 : 128以上，并且能有效保护乳鼠免受致命剂量病毒攻击，三价灭活疫苗诱导的免疫保护效果与各单价灭活疫苗类似，证明这3种病毒抗原并不存在免疫抑制现象，同时也发现这3种单价疫苗对其他2种病毒不存在交叉保护作用，为将来HFMD多价疫苗的研制迈出了第一步。

动物模型是疫苗研发过程中的重要一环，理想的动物模型可以加快疫苗的研发进程。目前已建立的能同时感染EV71和CV-A16病毒的动物模型有小鼠恒河猴和沙鼠。Yu等^[25]发现当小鼠日龄 > 6 d，小鼠对EV71临床株不敏感；Wang等 ^{[26 – 27]}使用鼠适应株EV71/MP4可延长小鼠对病毒敏感期至14 d，并能模拟临床病人出现的神经系统病变。由于鼠适应株在某些关键氨基酸位点存在突变，它不能完全反应临床毒株的所有特性。使用免疫缺陷小鼠如AG129或表达人源Scarb2受体的转基因小鼠可延长小鼠对病毒的敏感性，然而AG129小鼠和转基因小鼠并不能模拟EV71病人的主要死因——神经源性肺水肿^[28]，且转基因小鼠的遗传稳定性有待进一步确认^[29]。Mao等^[30]构建了CV-A16病毒感染小鼠模型，发现CV-A16病毒在肌肉组织增殖较好，同EV71病毒类似，7日龄以上小鼠对CV-A16不敏感，鼠适应株CV-A16-MAV可对14日龄小鼠敏感^[31]。Yang等^[32]利用CA6临床株CA6/141感染1日龄的BALB/C小鼠，构建了CA6感染小鼠模型，病毒在小鼠皮肤组织的大量增殖与临床患儿症状类似，并用该模型完成了对CA6治疗性抗体1D5和CA6灭活疫苗的免疫保护效果评价。小鼠模型是目前世界上遗传背景最清楚、应用最广泛的动物模型，已上市的EV71疫苗免疫学效果评价也用了小鼠模型，然而由于7日龄以上小鼠对EV71和CV-A16临床株不敏感，该模型只能用于疫苗的被动免疫保护效果和母传抗体保护效果评价，不能用于疫苗的主动免疫效果评价，有一定局限性；同时由于乳鼠个头太小，实验操作相对困难，疫苗接种过程中容易出现漏液现象。

非人灵长类动物恒河猴是跟人体最接近的HFMD动物模型，中国医学科学院的Zhang等^[33]发现EV71病毒可通过颅内注射、血液、呼吸道和消化道4种途径感染成年恒河猴，感染的恒河猴不仅可出现病毒血症和类似临床病人的中枢神经系统病变，还可以模拟神经源性肺水肿，血液中也检测到了一定滴度的中和抗体（1 : 16）；EV71病毒亦可感染8月龄的幼年恒河猴，幼年恒河猴在足部和口部出现的疱疹与HFMD患儿类似^[34]，以上表明恒河猴是良好的EV71病毒感染动物模型。Wang等^[35]发现CV-A16病毒同样可以感染恒河猴，并诱导其手、足和口部出现疱疹，但是CV-A16病毒并不能诱导恒河猴产生有效的免疫应答，感染恒河猴血液中的中和抗体滴度很低，大部分只有1 : 4，同时CV-A16灭活疫苗免疫后的恒河猴虽然能产生中和抗体（< 1 : 64），但诱导的中和抗体并不能保护恒河猴免受CV-A16病毒的再次感染，因此恒河猴模型在用于CV-A16疫苗的免疫效果评价中存在一定问题，也限制了其在EV71/CV-A16双价及HFMD多价疫苗的应用。

长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）又称沙鼠，分类学上属于仓鼠科、沙鼠属，大小介于大鼠和小鼠之间，作为实验动物在医学领域的应用已有30多年历史，是研究脑梗塞，癫痫和丝虫病等疾病的理想动物模型^{[36 – 37]}。本团队Yao等^[38]首次使用EV71临床株58301构建EV71病毒感染沙鼠动物模型，发现21日龄及以下沙鼠对EV71病毒100 %敏感，病理切片发现沙鼠神经组织出现病变，感染沙鼠出现的行动迟缓、嗜睡及后肢瘫痪等症状也与临床上感染EV71病毒后出现神经系统损伤病人的症状类似，沙鼠发病进程也与重症病人类似，表现为突然发病，发病后迅速死亡。同时Xu等^[39]发现沙鼠可模拟EV71感染所致HFMD病人的主要死因——神经源性肺水肿，而免疫EV71灭活疫苗或EV71抗体可有效保护沙鼠免受病毒攻击。本团队在此基础上又建立了CV-A16病毒感染沙鼠模型^[40]，同样发现21日龄沙鼠对CV-A16临床株CV-A16-194完全敏感，且出现胶质细胞增生、神经元变性、噬神经现象等与临床重症病人类似的神经系统病变，同时疫苗免疫沙鼠后产生的中和抗体滴度较高，加强免疫1周后抗体几何平均滴度达1 : 120，免疫12周后仍具有保护效果的中和抗体滴度（< 1 : 8）。由于沙鼠感染EV71和CV-A16病毒后能产生较强的免疫应答，且21日龄沙鼠对EV71和CV-A16病毒均完全敏感，因此可用沙鼠评价EV71/CV-A16双价疫苗的主动免疫保护效果；同时因沙鼠个头比小鼠大，实验操作相对容易，疫苗接种过程中也更不容易出现漏液现象，从而弥补小鼠模型的不足。

HFMD在亚太地区的流行已有10多年，期间HFMD的病原谱发生了变化，除了先前的EV71和CV-A16病毒外，CA6和CA10病毒占HFMD病原体的比例增加，HFMD疫苗的研发策略也应随着病原谱的改变而做出相应调整。虽然我国具有自主知识产权的EV71单价灭活疫苗已经上市，然而EV71单价疫苗并不能防止其他肠道病毒引起的HFMD，且很容易给公众造成片面印象，不利用疫苗的推广，若多价疫苗能研制成功，公众的接受度会大大提高，我国的HFMD发病率也会明显下降。同时虽然肠道病毒B组和C组病毒感染所致的HFMD是一些散发病例，病例数不多，但肠道病毒B组的CV-B3可引起急性心肌炎，CV-B5病毒和埃可病毒30可引起脑炎和无菌性脑膜炎，后果均比较严重，CV-B3疫苗在国外已研究多年^[41]，如果研制成功是对目前EV71单价灭活疫苗的一个很好补充，同时针对CV-B5病毒和埃可病毒30的预防也是未来多价疫苗的发展方向之一。

目前研究的HFMD多价疫苗主要集中在EV71/CV-A16双价疫苗，由于EV71单价灭活疫苗已上市，CV-A16单价灭活疫苗的生产工艺、质控体系等均可借鉴已有成功经验，疫苗的研制周期会相对缩短，同时先前研究已表明EV71和CV-A16抗原间不存在免疫干扰现象，因此EV71/CV-A16双价全灭活疫苗可能会最先上市。疫苗株筛选一直是疫苗研发过程中的重点，理想的疫苗株应具备对其他亚型毒株良好的交叉保护效果。已上市的EV71疫苗选取的疫苗株均为EV71 C4亚型，该亚型疫苗株对B4，B5，C2和C5等其他亚型毒株均有较好的交叉保护效果^[42]。对于CV-A16疫苗株而言，前期研究也发现CV-A16的B型毒株对A型和B型病毒均有保护，且大陆流行的CV-A16毒株主要为B1亚型，从CV-A16 B1亚型病毒中选取疫苗株不失为一种好的选择。在动物模型方面，由于小鼠模型对CV-A16敏感性较差，恒河猴模型感染CV-A16病毒后免疫应答弱，动物模型的局限性影响了多价疫苗的免疫原性和保护性评价。本团队建立的沙鼠模型对EV71和CV-A16病毒敏感性优于小鼠模型，且感染病毒后均能产生很好的免疫应答，今后可作为评价EV71/CV-A16双价疫苗的一个候选模型。同时应尽快建立CA6，CA10等其他肠道病毒的动物模型，为后续多价疫苗的研制做准备。

HFMD除了在亚太地区流行以外，在欧洲，北美甚至是非洲都有零星的HFMD流行报道^[43]，随着各大洲之间人员流动的加剧，HFMD很有可能成为一个全球性的公共卫生问题，而到那时，巨大的经济利益也将促使国际疫苗巨头加入HFMD多价疫苗的研发行列。目前我国在HFMD疫苗研制方面处于国际领先水平，应加大对HFMD多价疫苗的研发力度，保持我国在此疫苗领域的主导地位。