甲醛是一种廉价、无色易挥发的有机化合物。在建筑材料如人造板和油漆中被广泛使用。近年来逐渐成为人们室内空气污染的主要因素。食品中添加甲醛的事件也屡见不鲜，如海鲜类，青菜等。研究表明甲醛不仅有致敏、致畸形、致突变、致癌等危害，长期摄入甲醛对人类和动物的认知能力也有损害作用^{[1 – 5]}。本研究采用ICR小鼠作为实验对象，探讨甲醛摄入引起认知功能障碍的相关机制。结果报告如下。

甲醛，浓度37%～40%（无锡亚盛公司，批号：20140922）；脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、络氨酸激酶受体（tyrosine kinases receptor B，TrkB）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉Elabscience公司，货号分别为：M0203，M0815，M0821）。新物体辨别实验装置为正方形（50 cm × 50 cm × 25 cm）（沈阳医学院公共卫生学院自制）；MT-200 Morris水迷宫装置（成都泰盟软件有限公司）；酶标定量测试仪（奥地利TECAN公司）；低温超速离心机（美国BECK-MAN公司）；机械匀浆机（上海净信科技公司）。

8周龄ICR小鼠（28～33 g），由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2014–0004。小鼠按体重随机分为对照组、甲醛高、中、低剂量组（200、150、100 mg/kg），每组10只，雌雄各半。环境温度21～24 ℃，湿度50%～60%，12 h循环光照，自由摄食饮水。ICR小鼠适应环境1周后，采用灌胃方式给予不同剂量甲醛，对照组给予等量生理盐水；连续8周。

实验分为2部分：（1）适应环境：第1 d将每只小鼠依次放入实验装置自由探索10 min；（2）测试部分：第2 d采用2个相同物体放置于距两边距离相等且与一边平行的位置。放入1只小鼠自由探索，测试5 min，分别记录小鼠探索2个相同物体的时间tA1和tA2；小鼠与测试物体距离< 2 cm视为探索；探索结束后1 h把测试物体其中一个换成另一个材质、形状均不同的新物体再测试5 min，记录小鼠探索2个不同物体的时间tA1’和tB。测试采用组间一致的原则。优先指数计算公式（preferential index）（1 h） = tB/（ tA1' + tB）^[6]。

水温设置为22～25 ℃，实验分为3部分：（1）第1 d适应环境：在无安全台的情况下每只小鼠自由探索1 min；（2）第2～6 d定向航行：将小鼠从2个入水口放入水中，探索安全台位置（探索时间为潜伏期）；数据采集时间为60 s，每天上下午各训练1次，连续训练5 d，若小鼠在规定时间内未找到安全台，则逃避潜伏期记为60 s；操作者诱导动物到达安全平台，停留10 s，电脑同时进行数据采集并记录逃避潜伏期及游泳路程。（3）第7 d空间探索：撤除安全台，将小鼠放入水池中，自由探索60 s；摄像系统记录在60 s内小鼠在安全平台所在象限游泳的时间、路程及穿越安全平台所在位置的次数。

行为学实验结束后，用3.5 %水合氯醛麻醉后处死小鼠。取海马组织快速液氮冷冻后置于 – 70 ℃冰箱备用。提取小鼠海马组织约6 mg，按1 : 9的重量体积比加入预冷磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）超声匀浆5 000 g离心10 min提取蛋白并定量。按照ELISA试剂盒说明在抗小鼠BDNF抗体包被的酶标孔内加入实验样品，辣根过氧化物酶标记的亲和素及显色底物。37 ℃温育30 min，终止反应后450 nm波长处测吸光度（A）值。

数据采用 $\bar x \pm s$ 表示，应用SPSS 20.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果显示，与对照组比较，中、高剂量甲醛组小鼠新物体辨别优先指数及辨别系数明显降低（P < 0.01）；各组小鼠探索总时间无明显差异。

表 1

表 1 甲醛对ICR小鼠新物体辨别能力影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10） 组别（mg/kg） 新物体辨别 优先指数（%） 辨别系数（%） 探索总时间（s） 对照组 0.64 ± 0.05 0.28 ± 0.11 5.75 ± 1.19 甲醛 100 0.55 ± 0.09 0.09 ± 0.13 7.01 ± 1.32 150 0.49 ± 0.11a 0.01 ± 0.21a 5.94 ± 1.92 200 0.48 ± 0.08a 0.02 ± 0.16a 6.18 ± 2.06 　注：与对照组比较，a P < 0.01。

表 1 甲醛对ICR小鼠新物体辨别能力影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10）

定向航行结果显示，与对照组比较，训练第3天后，中、高剂量甲醛组小鼠逃避潜伏期明显延长（P < 0.05）；空间探索实验结果显示，与对照组比较，中、高剂量甲醛组小鼠穿台次数明显减少（ P < 0.05）。

表 2

表 2 甲醛对ICR小鼠水迷宫实验潜伏期及目标象限穿台次数影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10） 组别（mg/kg） 潜伏期（s） 穿台次数 第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 第5 d 对照组 59.23 ± 1.60 51.97 ± 14.04 29.41 ± 18.32 36.05 ± 17.71 22.43 ± 16.76 2.50 ± 2.06 甲醛 100 59.41 ± 1.56 50.04 ± 7.81 48.58 ± 6.18 44.43 ± 2.86 29.43 ± 8.33 1.80 ± 0.27 150 59.80 ± 0.25 57.25 ± 8.33 56.51 ± 8.01a 48.72 ± 18.06a 54.34 ± 15.51a 0.61 ± 0.70a 200 58.79 ± 3.42 58.12 ± 3.72 53.46 ± 10.64a 57.51 ± 7.53a 56.52 ± 10.71a 1.30 ± 1.163b 　注：与对照组比较，a P < 0.01，b P < 0.05。

表 2 甲醛对ICR小鼠水迷宫实验潜伏期及目标象限穿台次数影响（ $\bar x \pm s$ ，n = 10）

与对照组比较，各剂量甲醛组小鼠脑内BDNF、TRKB、NGF含量明显降低（P < 0.05）。

表 3

表 3 甲醛对ICR小鼠脑内神经营养因子表达影响（pg/mL， $\bar x \pm s$ ，n = 10） 组别（mg/kg） 神经营养因子 BDNF TrkB NGF 对照组 167.51 ± 3.14 129.35 ± 5.34 82.46 ± 2.57 甲醛 150 121.19 ± 3.07a 85.63 ± 3.36b 54.44 ± 2.64s 200 101.87 ± 2.95b 72.26 ± 1.78b 33.93 ± 4.06b 　注：与对照组比较，a P < 0.01，b P < 0.05。

表 3 甲醛对ICR小鼠脑内神经营养因子表达影响（pg/mL， $\bar x \pm s$ ，n = 10）

甲醛作为一种常见的污染物，可通过血脑屏障，长期摄入可引起人类神经元及神经节的改变进而引起情感和行为障碍^[7]。主要机制可能为甲醛与机体的核酸、蛋白质及一些神经递质等发生化学反应，并进一步影响其结构与功能^[8]。研究表明吸入甲醛0.5 mmol/L以及侧脑室注射甲醛均可引起啮齿类动物空间学习记忆障碍^[5]。赵云等^[4]研究发现甲醛经口染毒2 mg及20 mg组未引起氧化损伤，200 mg甲醛暴露对小鼠器官造成明显的氧化损伤。本研究采用100、150、200 mg 3个剂量组连续灌胃给予8周，甲醛组实验动物体重有所降低，但无统计学差异。这与已有文献^[5]报道不同，可能为长期给药后动物耐受的结果。本研究分别采用新物体辨别实验和Morris水迷宫实验评价小鼠的学习记忆能力，前者主要评价小鼠对事物及位置辨别能力，而后者主要侧重评价小鼠空间记忆能力。本研究结果显示，新物体辨别实验中，甲醛中、高剂量组小鼠优先指数及辨别系数均明显低于对照组；中、高剂量甲醛组小鼠逃避潜伏期明显延长。提示，甲醛连续灌胃给药8周后可导致小鼠明显的学习记忆障碍。

哺乳动物体内的神经营养因子主要有NGF、BDNF、神经营养素–3（NT-3）及神经营养素–4/5（NT-4/5）等^[9]。研究表明BDNF在脑内多种生理功能调节方面起到重要作用，包括促进神经元分化生长，维持神经元存活和正常功能，特别是突触可塑性和长时程增强^{[10 – 11]}。老龄大鼠的内嗅皮层注入BDNF蛋白可逆转年龄相关的海马基因表达，提高海马依赖性的学习和记忆功能^[12]。BDNF结合TrkB受体后，能够激活细胞内3条信号通路：分别为细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，MEK-ERK）、磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinas，PI3K）和磷脂酶CPLC-γ （phospholipase Cγ），这3条信号通路在维持神经增长，神经细胞分化和神经元的存活发挥重要作用，在维持成年人的突触可塑性，大脑神经元结构和功能中也发挥作用^[13]。此外，BDNF还能通过前脑胆碱能神经系统对学习记忆发挥作用。胆碱能神经元参与学习记忆功能，并发出纤维投射到海马及大脑皮质的广泛区域^[14]。本研究结果显示，与对照组比较，甲醛组小鼠脑内BDNF、NGF等神经营养因子表达减少，TrkB含量也明显下降。提示，甲醛可导致小鼠学习记忆能力下降，其机制可能与小鼠脑内BDNF等神经营养因子表达下降，不能激活下游信号通路有关。