2017, Vol. 33
2. 新疆博州职业技术学院;
3. 湖北医药学院附属太和医院医学影像中心;
4. 湖北医药学院附属人民医院老年医学科
老年性痴呆(senile dementia of the Alzheimer type，SDAT)，是严重危害中老年人身心健康的脑慢性、进展性、退行性疾病[1-2]。其主要临床表现为伴随着年龄增长、出现进行性的学习记忆能力下降。发病机制与细胞外出现由β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)形成的老年斑(senile plaques，SP)，细胞内产生由异常磷酸化tau蛋白(p-tau)构成的神经元纤维丝缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及大脑皮质、海马神经元数量减少、突触丢失有关[3-4]。绞股蓝属于葫芦科绞股蓝属植物，又名七叶胆，为中国名贵中草药，湖北十堰地区绞股蓝资源较为丰富；其主要活性成分为绞股蓝皂甙(Gynostemma pentaphyllum Makino，GPM)[5]。研究发现，GPM能对抗自由基的氧化损伤、修复线粒体的超微结构进而改善SDAT鼠的认知能力[6-8]。本研究探讨GPM对SDAT小鼠学习记忆能力影响及机制，旨在为绞股蓝资源开发利用提供依据。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂MT-200水迷宫行为学跟踪系统(成都泰盟科技有限公司)；D-半乳糖(纯度＞98%)、亚硝酸钠(纯度＞98%)、三氯化铝(纯度＞98%)(南京建成生物工程研究所)；GPM(无色粉末，纯度＞98%)(西安康威生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；可溶性淀粉样前体蛋白α(α secretase form of soluble amyloid precursor protein，sAPPα)、Aβ42酶联免疫法(ELISA)试剂盒(美国elabscience公司)；盐酸多奈哌齐片(十堰市太和医院)。
1.2 实验动物昆明小鼠70只，雄性，SPF(specific pathogen free)级，12月龄，体重(39±5)g，购于湖北医药学院实验动物中心，许可证号码：SCXK(鄂)2016-0008；给药前小鼠适应性喂养2周，自由饮食，每天光照12 h，室温20~24 ℃；采用行为学试验剔除逃避反应明显迟缓者。
1.3 小鼠痴呆模型复制使用D-半乳糖联合亚硝酸钠、三氯化铝建立SDAT小鼠模型，D-半乳糖配制成水溶液，按照500 mg/kg行颈、背部皮下注射；亚硝酸钠配制成水溶液，按照45 mg/kg行颈、背部皮下注射；三氯化铝配制成水溶液，按照40 mg/kg小鼠自由饮用；持续3个月。模型成功判定标准：水迷宫测试，潜伏期＞40 s，并随机抽取10%做病理学检查，出现海马神经元减少、Aβ斑或神经元纤维变性，则该批小鼠确定为SDAT小鼠模型成功。
1.4 分组与处理取SDAT模型小鼠50只，随机分为模型组、GPM低、中、高剂量(50、150、250 mg/kg)组、多奈哌齐组(3 mg/kg阳性对照[9-10])，每组10只；另取未造模小鼠10只为对照组；3个GPM组给予相应剂量的GPM；模型组和对照组给予同体积生理盐水。每天先称小鼠体重，并计算给药量，再灌胃给药，连续3个月。水迷宫测试结束即断头取脑，靠近枕骨，快速剪下小鼠头颅，放入冰盘，剔除颅骨周围软组织，暴露颅骨表面；沿中线剪开顶骨，直至顶骨、额骨交汇处，用镊子将顶骨向外侧掀开；将脑组织与脑膜、颅骨轻轻分离，剪断相连脑神经，取出全脑；仔细分离出大脑皮质、海马，置入EP管，放液氮中保存，待用。
1.5 指标与方法 1.5.1 行为学测试(1) 定位航行实验：连续训练5 d，每天3次；从不同象限下水，小鼠头朝池壁、去寻找平台，记录每只小鼠找到并爬上平台的时间即潜伏期；若超过60 s未找到平台，以60 s计；每一轮训练间隔30 min。(2)空间探索实验：除去平台，让小鼠自由地探索目标平台，时间30 s；记录每只小鼠第一次穿越原平台位置时间及在原平台象限活动时间。
1.5.2 脑组织中抗氧化指标与Aβ42检测(1) 抗氧化指标检测：从液氮中取出小鼠皮质、海马，称量、剪碎，按质量、体积比1:9加入4 ℃生理盐水，用匀浆机制成10%匀浆液，离心、取上清，并分装于EP管备用。按照试剂盒说明书操作，分别测定小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。(2)Aβ42表达检测：取小鼠脑皮质、海马组织，匀浆、离心，收集上清液；依据sAPPα、Aβ42试剂盒说明书步骤操作，于450 nm处测定吸光度(A)值，计算出脑组织中sAPPα、Aβ42含量。
1.6 统计分析计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析；组间比较运用方差分析，两两比较采用q检验；检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 GPM对痴呆小鼠体重影响结果显示，对照组、模型组、多奈哌齐组、GPM 50、150、250 mg/kg组小鼠体重分别为(40.68±3.27)、(41.08±3.65)、(40.18±3.45)、(41.33±3.52)、(41.36±3.82)、(40.67±3.98)g；各组小鼠体重差异无统计学意义(F=1.954，P＞0.05)。
2.2 GPM对痴呆小鼠学习记忆能力影响(表 1)
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表 1 GPM对痴呆小鼠学习记忆能力影响(s，x±s，n=10) |
与对照组比较，模型组小鼠平均潜伏期、首次穿越平台时间延长，在原平台活动时间缩短；与模型组比较，多奈哌齐组、GPM 150、250 mg/kg组小鼠潜伏期、首次穿越平台时间缩短，在原平台活动时间延长，差异有统计学意义(均P＜0.05)。
2.3 GPM对痴呆小鼠脑组织中抗氧化指标影响(表 2)|
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表 2 GPM对痴呆小鼠脑组织中抗氧化指标影响(x±s，n=10) |
与对照组比较，模型组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高；与模型组比较，多奈哌齐组、GPM 150、250 mg/kg组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低，差异有统计学意义(均P＜0.05)。
2.4 GPM对痴呆小鼠脑组织sAPPα和Aβ42表达影响(表 3)|
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表 3 GPM对痴呆小鼠脑组织sAPPα和Aβ42表达影响(x±s，n=10) |
与对照组比较，模型组小鼠sAPPα含量降低，而Aβ42含量升高；与模型组比较，多奈哌齐组、GPM 150、250 mg/kg组小鼠sAPPα含量升高，但Aβ42含量降低，差异有统计学意义(均P＜0.05)。
3 讨论老年性痴呆发病机制和防治方法研究进展较慢，其根本原因与没有统一、经典、特异的动物模型有关[11]。现有多种SDAT模型(如损伤型、老化型、转基因型、脑缺血型、胰岛素抵抗型等)只是在一个局部或一个点反映SDAT病理变化，不能全面表达SDAT的病理、生化及神经行为学等方面的变化特征，不适宜做抗SDAT的药物研究[12-13]。本研究选择D-半乳糖、亚硝酸钠和三氯化铝对小鼠联合慢性作用，模型动物认知功能明显障碍，同时出现类SDAT病理学改变，提示，模型复制成功[14]；它能较好地模拟SDAT患者的发病环境、发病过程、病理特征、认知变化等，是更贴近人类SDAT的复合模型[15-18]。
绞股蓝全草含甙类、甾醇、黄酮、氨基酸及微量元素等多种活性物质，而GPM是其中活性最强的成分。GPM是与人参皂甙有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂甙，具有复合生理活性，其中抗癌、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、镇静、镇痛、降血脂等作用，已得到药理学和临床研究的证实[19-21]。水迷宫实验中潜伏期越短，学习能力越强；穿越原平台位置的潜伏期越短或者在原平台象限活动时间长，表示记忆能力较强。本研究结果显示，与模型组比较，GPM 150、250 mg/kg组小鼠潜伏期明显缩短、在原平台活动时间明显延长。与以往研究结果一致[22-25]。提示，GPM具有改善痴呆小鼠学习记忆能力作用。
SOD、GSH-Px是有机体内主要抗氧化酶，它们在大脑皮质、海马等组织中对抗氧自由基等物质的损伤；而MDA是脂质过氧化产物，其在脑组织中含量的多少是过氧化状态的直接反映[1]。在一般情况时，氧自由基的产生与抗氧化酶对其清除呈现一种动态平衡。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力下降、MDA含量上升；与模型组比较，GPM 150、250 mg/kg组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力升高、MDA含量下降。提示，GPM可促进氧自由基的清除，同时减轻氧自由基介导的脂质过氧化，并降低MDA浓度[26-29]。
SDAT发病机制尚未完全阐明，目前广为接受的是Aβ级联假说。Aβ来源于一种跨膜蛋白即β-淀粉样前体蛋白(APP)的水解，APP可通过2条途径、3种分泌酶(α、β、γ)裂解代谢。一条是非Aβ源途径，主要在α-分泌酶作用下，APP产生大量可溶性sAPPα和C83片段，后者被γ-分泌酶水解产生一个3 kDa的小片段P3和APP胞内区域羧基末端；这一途径分泌的可溶性sAPPα对神经元的营养和保护作用已得到充分证实[4]。另一条是Aβ源途径，在β-分泌酶作用下，APP产生sAPPβ和C99 2个片段，后者被γ-分泌酶水解生成β-淀粉样多肽Aβ 40和Aβ42 2种异体；Aβ 40溶解度较好，而Aβ 42溶解度极低，会迅速积聚在神经元之间，形成纤维状物质，即老年斑(SP)的主要成分；SP可引发一连串的神经毒性反应，最终出现神经元功能失调、细胞死亡以及大脑认知障碍等病理现象。本研究结果显示，与模型组比较，150、250 mg/kg GPM组小鼠sAPPα表达增加而Aβ42表达下降，这与Aβ级联假说相吻合[3]。
本研究中以多奈哌齐为阳性对照组，结果显示，3 mg/kg多奈哌齐作用与150 mg/kg GPM效果相当。盐酸多奈哌齐抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解，提高脑神经元突触内乙酰胆碱的浓度，兴奋胆碱能神经，从而提高小鼠的学习记忆能力[9-10]。但本研究为氧化损伤SDAT模型，小鼠皮质、海马神经元数量丢失、结构损伤明显，因此，多奈哌齐的作用十分有限。
综上所述，GPM对SDAT小鼠学习记忆能力具有一定改善作用[30]，其机制可能与GPM减轻小鼠脑组织氧化损伤、减少脑组织Aβ表达有关。
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