金属对SH-SY5Y细胞氧化应激及Aβ蛋白沉积影响

引用本文

朱敬丽, 吴越, 路赵硕, 王声远, 姚建, 王鑫鑫, 王德才. 金属对SH-SY5Y细胞氧化应激及Aβ蛋白沉积影响[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(11): 1591-1594. 复制到剪切板

ZHU Jing-li, WU Yue, LU Zhao-shuo, et al. Impacts of metal elements on oxidative stress and Aβ protein deposition in SH-SY5Y cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(11): 1591-1594. 复制到剪切板

金属对SH-SY5Y细胞氧化应激及Aβ蛋白沉积影响

朱敬丽, 吴越, 路赵硕, 王声远, 姚建, 王鑫鑫, 王德才

哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室, 黑龙江哈尔滨 150081

收稿日期: 2016-09-28; 数字出版日期: 2016-12-23 14:14.

基金项目: 国家自然科学基金（81273193）

作者简介: 朱敬丽(1989-), 女, 山东沂水人, 硕士在读, 研究方向:阿尔茨海默病金属生物标志物。

通讯作者: 王德才, E-mail:decaiwang@live.cn

摘要：目的探讨铜、铁、锌、铝金属对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的氧化应激及β淀粉样蛋白（Aβ）沉积影响，为预防老年性痴呆提供依据。方法采用不同剂量的铜、铁、锌、铝分别作用于SH-SY5Y细胞，通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长活性，黄嘌呤氧化酶法检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活力，比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，硫代巴比妥酸法检测脂质过氧化产物丙二醛含量，2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平，酶联免疫（ELISA）试剂盒法测定细胞内Aβ_1-42蛋白含量。结果铜、铁、锌、铝呈剂量依赖性地抑制细胞活性，50、200、400 μmol/L CuSO₄组SH-SY5Y细胞存活率分别为90.47%、74.81%、64.97%，1、2、4 mmol/L FeSO₄、AlCl₃组SH-SY5Y细胞存活率分别为93.08%、78.28%、56.10%和92.21%、85.30%、62.72%，50、100、200 μmol/L ZnSO₄组SH-SY5Y细胞存活率分别为91.76%、76.51%、61.27%；与对照组比较，各剂量金属组SH-SY5Y细胞存活率均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；与对照组比较，各剂量铜、铁、锌、铝组SH-SY5Y细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活性明显下降，ROS水平和丙二醛、Aβ_1-42含量明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论铜、铁、锌、铝可致神经细胞毒性作用和Aβ蛋白沉积，其机制可能与金属诱导细胞内ROS产生并导致氧化损伤有关。

关键词：铜铁锌铝 β淀粉样蛋白(Aβ) 人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y) 氧化损伤

Impacts of metal elements on oxidative stress and Aβ protein deposition in SH-SY5Y cells

ZHU Jing-li, WU Yue, LU Zhao-shuo, et al

School of Public Health, Medical College of Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province 215006, China

Abstract: Objective To study the effects of copper (Cu), iron (Fe), zinc (Zn), and aluminum (Al) exposure on oxidative stress and beta amyloid (Aβ) protein deposition in human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and to provide evidences for senile dementia prevention. Methods SH-SY5Y cells were treated with various doses of Cu, Fe, Zn, and Al, respectively.The viability of the cells was determined with 3-[4, 5-dimedthylthiazol]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.The activity of superoxide dismutase (SOD) in cultured SH-SY5Y cells was detected with xanthine oxidase method; the activity of glutathione peroxidase (GSH-PX) was measured with colorimetry; the content of malondialdehyde (MDA) in culture supematant fluid was assessed with thiobituric acid reaction (TBA) method.Cellular reactive oxygen species (ROS) level was detected using fluorescent probe of 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA).The content of Aβ_1-42 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Cu, Fe, Zn, and Al could suppress the viability of SH-SY5Y cells in a concentration-dependent manner.When treated with copper sulfate (CuSO₄) at the dosages of 50, 200, and 400 μmol/L, the survival rates of the SH-SY5Y cells were 90.47%, 74.81%, and 64.97%;at the dosages of 1, 2, and 4 mmol/L, the survival rates of the SH-SY5Y cells were 93.08%, 78.28%, and 56.10% when exposed to ferrous sulfate (FeSO₄) and 2.21%, 85.30%, and 62.72% when exposed to aluminum chloride (AlCl₃); the survival rates of the the SH-SY5Y cells were 91.76%, 76.51%, and 61.27% when treated with zinc sulfate (ZnSO₄) at the dosages of 50, 100, and 200 μmol/L, respectively.The survival rates of the SH-SY5Y cells exposed to various concentrations of the four metallic compounds were all significantly lower than that of the blank control group (P < 0.05 for all).When treated with the four metallic compounds, the intracellular activity of SOD decreased but the intracellular ROS increased significantly; the activity of GSH-PX declined but the content of MDA and Aβ_1-42 increased significantly in culture supematant fluid compared to those of the control (all P < 0.05). Conclusion Copper, iron, zinc, and aluminum compounds could induce damage in SH-SY5Y cells and result in deposition of Aβ protein by ROS generation and oxidative stress pathway.

Key words: copper iron zinc aluminum β-amyloid human neuroblastoma cell line oxidized damage

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，又称老年性痴呆，是发生在老年前期及老年期的一种原因不明以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经变性疾病，占老年神经退行性疾病的60%~80%^[1]。AD典型病理改变为细胞外间隙的β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)和细胞内多聚Tau蛋白沉积形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)^[2]，其中Aβ在脑内沉积被普遍认为是AD病理改变的中心环节，具有神经毒性^[3]。AD的发病机制极为复杂，目前氧化应激作用备受关注，而Aβ和金属离子动态平衡紊乱等因素诱导产生的氧化应激是阿尔茨海默病(AD)形成的关键因素。金属离子如铜、铁、锌、铝等在海马、大脑皮层等部位广泛参与Aβ的生成过程^[4]。研究表明活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加引起的氧化应激与AD的发病机制有着重要关系^[3]。本研究以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为模型，探讨铜、铁、锌、铝等金属的神经毒性及作用机制，旨在为预防老年性痴呆提供依据，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

SH-SY5Y细胞(北京协和细胞资源中心)，结晶硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、结晶硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)、结晶硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)、结晶氯化铝(AlCl₃·6H₂O)(美国Sigma公司), 1640培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，四甲基噻唑蓝(3-[4, 5-dimedthylthiazol]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)、ROS检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Aβ_1-42试剂盒(北京博奥拓达生物科技公司)；细胞培养箱(美国TE-HER公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞培养与分组

倒置相差显微镜下观察SH-SY5Y细胞贴壁生长均匀，形态呈梭形、多触角形。用含15%胎牛血清的1640培养基，置于CO₂培养箱(37 ℃，5%CO₂，100%湿度)中培养，每4~7 d传代1次。实验设对照组，低、中、高剂量金属组：50、200、400 μmol/L CuSO₄组，50、100、200 μmol/L ZnSO₄组，1、2、4 mmol/L FeSO₄与AlCl₃组；每组设6个复孔。

1.3 指标与方法 1.3.1 SH-SY5Y细胞存活率检测

采用MTT法，SH-SY5Y细胞以2×10⁵个/mL密度接种至96孔板，细胞生长汇合率达80%~90%时，加入不同剂量金属，作用24 h后，每孔加10 μL MTT(5 mg/mL)，置于37 ℃，5%CO₂培养箱中孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡后于570 nm处测定其吸光度(A)值；细胞存活率(%)=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。

1.3.2 SH-SY5Y细胞氧化应激指标检测

取对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×10⁶个/mL密度接种于6孔板中，每孔2 mL，加入不同剂量金属，培养24 h后，离心分别收集培养上清及细胞，测定细胞培养液中GSH-Px活性及丙二醛含量，细胞内SOD活性，按试剂盒说明书操作。

1.3.3 SH-SY5Y细胞内ROS水平检测

采用荧光探针法，将SH-SY5Y细胞以1×10⁵个/mL密度接种于6孔板上，加入不同剂量金属，培养24 h，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)洗涤细胞2次，加入2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针, 使其终浓度为10 μmol/L，37 ℃孵育20 min。每孔加入细胞裂解液800 μL，裂解充分后，在激发波长为488 nm, 吸收波长为525 nm下用荧光酶标仪检测细胞内ROS的荧光强度。

1.3.4 SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量检测

将密度为1×10⁶个/mL SH-SY5Y细胞接种于6孔板中，每孔2 mL，加入不同剂量金属，培养24 h后，将离心收集的SH-SY5Y细胞破碎制成细胞悬液，按试剂盒说明书进行测定。

1.4 统计分析

数据以x±s表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差法，检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 各金属对SH-SY5Y细胞存活率影响(表 1)

表 1 各种金属对SH-SY5Y细胞存活率影响(%, x±s，n=6)

结果显示，与对照组比较，CuSO₄组SH-SY5Y细胞存活率明显下降(P < 0.05)；与50 μmol/L组比较，200、400 μmol/L组SH-SY5Y细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，2、4 mmol/L FeSO₄组SH-SY5Y细胞存活率明显下降(P < 0.05)；与1 mmol/L组比较，2、4 mmol/L FeSO₄组SH-SY5Y细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，ZnSO₄组SH-SY5Y细胞存活率明显下降(P < 0.05)；与50 μmol/L组比较，100、200 μmol/L ZnSO₄组SH-SY5Y细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，2、4 mmol/L AlCl₃组SH-SY5Y细胞存活率明显下降(P < 0.05)；与1 mmol/L组比较，4 mmol/L组SH-SY5Y细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.2 各金属对SH-SY5Y细胞氧化应激指标影响(表 2)

表 2 各金属对SH-SY5Y细胞氧化应激指标影响(x±s，n=6)

组别	MDA (μmol/L)	SOD (U/mgprot)	GSH-Px (mmol/L)
CuSO₄
对照组	0.38±0.22	35.53±0.55	1.267±0.019
低剂量组	1.48±0.08^a	29.66±0.44^a	0.901±0.009^a
中剂量组	6.36±0.62^ab	20.41±0.44^ab	0.789±0.002^ab
高剂量组	12.20±1.09^ab	18.40±0.20^ab	0.284±0.056^ab
FeSO₄
对照组	0.48±0.08	35.53±0.55	1.267±0.019
低剂量组	3.52±0.91^a	26.53±0.39^a	0.193±0.006^a
中剂量组	19.89±0.70^ab	21.86±0.50^ab	0.152±0.006^ab
高剂量组	30.74±0.08^ab	16.20±0.28^ab	0.074±0.013^ab
ZnSO₄
对照组	1.21±0.15	35.53±0.55	1.267±0.019
低剂量组	2.54±0.52^a	32.50±0.48^a	0.130±0.003^a
中剂量组	8.10±0.81^ab	19.79±0.52^ab	0.095±0.013^ab
高剂量组	13.91±1.08^ab	17.61±0.43^ab	0.027±0.009^ab
AlCl₃
对照组	1.22±0.17	35.53±0.55	1.267±0.019
低剂量组	5.54±0.74^a	25.18±0.16^a	0.144±0.012^a
中剂量组	18.49±2.31^ab	19.87±0.15^ab	0.080±0.016^ab
高剂量组	31.32±1.20^ab	15.11±0.93^ab	0.029±0.003^ab
注：低、中、高剂量金属组：CuSO₄分别为50、200、400 μmol/L，FeSO₄、AlCl₃分别为1、2、4 mmol/L，ZnSO₄分别为50、100、200 μmol/L；与对照组比较，a P < 0.05；与低剂量组比较，b P < 0.05。

表 2 各金属对SH-SY5Y细胞氧化应激指标影响(x±s，n=6)

与对照组比较，随金属剂量增加，各金属组细胞培养上清液中GSH-Px活性逐渐降低，丙二醛含量逐渐升高，细胞内SOD活性降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量金属组细胞培养上清液中GSH-Px活性逐渐降低，丙二醛含量逐渐升高，细胞内SOD活性降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.3 各金属对SH-SY5Y细胞内ROS水平影响(表 3)

表 3 各种金属对SH-SY5Y细胞内ROS水平影响(x±s，n=6)

结果显示，金属各处理组细胞内ROS水平较对照组明显增加(P < 0.05)；与低剂量组比较，中、高剂量金属组细胞内ROS水平逐渐升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.4 各金属对SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量影响(表 4)

表 4 各种金属对SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量影响(μg/L, x±s，n=6)

结果显示，与对照组比较，各剂量CuSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量明显升高，400 μmol/L CuSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量高于50 μmol/L组，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，2、4 mmol/L FeSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量明显升高，2、4 mmol/L FeSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量明显高于1 mmol/L组，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，100、200 μmol/L ZnSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量明显升高，100、200 μmol/L ZnSO₄组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量高于50 μmol/L组，差异有统计学意义(P < 0.05)。与对照组比较，AlCl₃组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量明显升高，4 mmol/L AlCl₃组SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量高于1 mmol/L组，差异有统计学意义(P < 0.05)。

3 讨论

大量研究表明，氧化应激中产生的活性氧自由基(ROS)与AD的发生有密切关系，是AD发病的重要原因之一^[5]。阿尔茨海默病病理反应的分子β淀粉样前体蛋白(amyloid precursorprotein, APP)和Aβ蛋白均具有铜结合域，铜与Aβ结合，形成羟自由基和羰基化合物，具有氧化还原活性^[4]。细胞内铁含量增加，导致Aβ与铁结合，结合铁的Aβ能够引起ROS产生和Aβ积聚^[6]。体内锌浓度超载时，β-分泌酶及γ-分泌酶水解APP产生Aβ，导致AD的发生；同时锌或Aβ的聚集均会导致Aβ与铜、铁等相互作用，这种作用会导致锌诱导的细胞毒性和氧化应激^[7]。铝可促进Aβ生成，并和Aβ形成复合物，可增强Fe²⁺诱导产生的ROS水平；同时铝导致机体清除氧自由基的能力降低，加速机体氧化损伤，促进脂质过氧化^[8]。Aβ是APP通过β-分泌酶及γ-分泌酶剪切形成的长度为40或42个氨基酸残基片段，当Aβ沉积到一定程度能引起神经毒性，引发进一步的氧化应激作用，同时Aβ也可引起脂质过氧化和间接蛋白质氧化，形成脂褐质并沉积于细胞中，从而引发AD^[9]。

SOD、GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，丙二醛则为脂质过氧化的最终产物。本研究结果显示，铜、铁、锌、铝对SH-SY5Y细胞表现出一定的毒性作用(生存率下降)；染毒细胞后，细胞内SOD、GSH-Px活性同时降低，丙二醛含量升高，呈明显剂量效应关系；随着铜、铁、锌、铝染毒剂量增加，SH-SY5Y细胞内Aβ_1-42含量和ROS水平呈逐渐升高趋势。提示，金属离子铜、铁、锌、铝的毒性作用与ROS增加引起的氧化应激、抗氧化防御酶功能丧失和脂质过氧化有关；另外，铜、铁、锌、铝参与下产生的氧化应激产物ROS可通过氧化作用攻击脂质、蛋白质、核酸等生物大分子和诱导β-分泌酶及γ-分泌酶，切割APP产生Aβ；同时Aβ蛋白的沉积引发进一步的氧化应激，激活磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β(phosphatidylinositol-3 kinase protein kinase A/protein kinase B-glycogen synthase kinase 3β, PI3K-AKT/PKB-GSK3β)信号通路和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中的c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)/应激激活的蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)信号通路，引起tau蛋白过度磷酸化，导致神经细胞受损和功能紊乱的恶性循环，最终可能导致AD的发生。

参考文献

[1]	Galimberti D, Scarpini E. Progress in Alzheimer's disease[J]. Journal of Neurology, 2012, 259(2): 201–211. DOI:10.1007/s00415-011-6145-3
[2]	Gu X, Sun J, Li S, et al. Oxidative stress induces DNA demethylation and histone acetylation in SH-SY5Y cells:potential epigenetic mechanisms in gene transcription in Aβ production[J]. Neurobiology of Aging, 2013, 34(4): 1069–1079. DOI:10.1016/j.neurobiolaging.2012.10.013
[3]	Li Z, Hemmelgarn BT, Chuang CC, et al. The role of oxidative stress-induced epigenetic alterations in amyloid-β production in Alzheimer's disease[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2014, 8(6): 145–148.
[4]	Mayes J, Tinkermill C, Kolosov O, et al. β-amyloid fibrils in Alzheimer disease are not inert when bound to copper ions but can degrade hydrogen peroxide and generate reactive oxygen species[J]. Journal of Biological Chemistry, 2014, 289(17): 12052–12062. DOI:10.1074/jbc.M113.525212
[5]	唐伟, 张营丽, 王威. 阿尔茨海默病发病机制的研究进展[J]. 医学与哲学, 2014, 35(1B): 49–51.
[6]	Wan L, Nie G, Zhang J, et al. β-amyloid peptide increases levels of iron content and oxidative stress in human cell and Caenorhabditis elegans models of Alzheimer disease[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2011, 50(1): 122–129. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2010.10.707
[7]	Strozyk D, Launer LJ, Adlard PA, et al. Zinc and copper modulate Alzheimer Ab levels in human cerebrospinal fluid[J]. Neurobiology of Aging, 2009, 30(7): 1069–1077. DOI:10.1016/j.neurobiolaging.2007.10.012
[8]	Shati AA, Elsaid FG, Hafez EE. Biochemical and molecular aspects of aluminum chloride-induced neurotoxicity in mice and the protective role of Crocus sativus L.extraction and honey syrup[J]. Neuroscience, 2011, 175: 66–74. DOI:10.1016/j.neuroscience.2010.11.043
[9]	李娜, 程雪娇, 王茜, 等. 白藜芦醇抑制海马β-APP表达改善大鼠学习记忆[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(3): 327–329. DOI:10.11847/zgggws2015-31-03-22


中国公共卫生 2017, Vol. 33 Issue (11): 1591-1594	PDF