中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (10): 1462-1465   PDF    
引用本文
张洋婷, 韩丽琴, 郗艳丽, 冯小雨, 马洪波. 红景天多糖羧甲基化修饰及其抗氧化活性[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(10): 1462-1465.
ZHANG Yang-ting, HAN Li-qin, XI Yan-li, et al. Carboxymethylation and antioxidant activity of rhodiola polysaccharide[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(10): 1462-1465.
红景天多糖羧甲基化修饰及其抗氧化活性
张洋婷1,2, 韩丽琴3, 郗艳丽1,2, 冯小雨1,2, 马洪波1,2    
1. 吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132013;
2. 吉林省中医药管理局二级实验室;
3. 吉林医药学院药学院
收稿日期: 2017-01-23; 数字出版日期: 2017-5-23 9:58.
基金项目: 吉林省卫生计生委课题（2014ZC063）；吉林省教育厅项目（2015403）；吉林省教育厅课题（2013476）
作者简介: 张洋婷(1986-), 女, 吉林蛟河人, 助教, 硕士, 研究方向:营养与食品卫生。
通讯作者: 马洪波, E-mail:352309289@qq.com
摘要：目的 比较红景天多糖羧甲基化修饰前后抗氧化活性的变化。方法 采用水提醇沉法提取红景天多糖，正交实验优选红景天多糖羧甲基化修饰条件，通过对2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基和超氧阴离子自由基清除能力的测定，比较修饰前后红景天多糖抗氧化活性的变化。结果 红景天多糖羧甲基化修饰的最佳工艺条件为反应温度60 ℃、氯乙酸15 mg、反应时间3.5 h，得到羧甲基化的取代度为10.73。当浓度为5 mg/mL时，羧甲基化红景天多糖清除超氧阴离子自由基、ABTS自由基的能力分别为53.16%与45.64%，与红景天多糖比较，清除自由基能力明显提高。结论 与修饰前比较，羧甲基化修饰后红景天多糖具有较强的抗氧化活性。
关键词：红景天多糖     羧甲基化     抗氧化活性    
Carboxymethylation and antioxidant activity of rhodiola polysaccharide
ZHANG Yang-ting, HAN Li-qin, XI Yan-li, et al     
School of Public Health, Jilin Medical University, Jilin, Jilin Pro-vince 132013, China
Abstract: Objective To study the changes in antioxidant activity of rhodiola polysaccharide due to carboxymethylated modification. Methods Extraction of rhodiola polysaccharide was prepared with water extract-alcohol precipitation method.The conditions of carboxymethylated modification was optimized with orthogonal experiment.The elimination of 2, 2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS)-related free radicals and superoxide anion free radicals were detected before and after the modification of rhodiola polysaccharide to evaluate its antioxidant activity. Results The optimal reaction temperature was 60 ℃ for the carboxymethylated modification of rhodiola polysaccharide under the chloroacetic acid dosage of 15 mg, the etherification reaction time of 3.5 hours, and the carboxymethyl substitution degree of 10.73.At the concentration of 5 mg/mL, the carboxymethylated rhodiola polysaccharide-induced scavenging of superoxide anion radical and ABTS-related free radicals were was 53.16% and 45.64%, which were obviously higher than the scavenging activities of rhodiola polysaccharide. Conclusion Rhodiola polysaccharide is of strong antioxidant activity after being carboxymethylated.
Key words: rhodiola polysaccharide     carboxymethylation     antioxidant activity    

红景天(Rhodiola rosea L.)是景天科景天属多年生草本植物，又名蔷薇红景天，扫罗玛布尔(藏名)等[1]。红景天多糖提取物具有抗辐射、抑制肿瘤、提高免疫力等功效[2-4]，多糖是红景天的主要功效成分之一，具有耐缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤和调节血糖等多种药理作用[5-10]。但红景天多糖分子量较大，水溶性较差，影响红景天的药用功效。研究发现糖类经过化学修饰后可改变其理化性质和生物活性[11-16]，如水溶性增强、抗氧化能力增加等。目前对红景天多糖的研究主要集中在提取和药用价值等方面[17-19]，对其理化结构和生物活性的研究较少。本研究以氢氧化钠为碱化试剂，氯乙酸为醚化试剂，制备羧甲基化红景天多糖，以取代度为标准优化制备工艺，并探讨羧甲基修饰前后红景天多糖抗氧化活性的变化。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

红景天(产于中国西藏地区，购于吉林市大药房)样品经机械粉碎过60目筛，采用水提醇沉法提取红景天粗多糖，再采用Sevag试剂脱除其中蛋白质后，冷冻干燥制得红景天多糖；乙醚、氯乙酸、正丁醇、异丙醇、无水乙醇、甲醇等试剂均为分析纯。FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Vertex 70型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker Instrument公司)。

1.2 红景天多糖制备

称取红景天粉末5 g于圆底烧瓶中，加150 mL蒸馏水，于电热套上煮沸2 h，抽滤，再换50 mL蒸馏水煮1 h，抽滤，合并滤液，浓缩；将sevage试剂(V氯仿：V正丁醇=4:1) 按1:1的比例加入多糖溶液中，振荡5 min，静置30 min，取上清液，重复2次；再按1:5比例加入95%乙醇醇沉红景天多糖，避光低温放置24 h；将醇沉液抽滤，沉淀再依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤，得红景天粗多糖，含量为0.88%，得率为8.42%。

1.3 羧甲基化红景天多糖制备

称取干燥至恒重的0.1 g脱色脱蛋白红景天多糖于三颈瓶中，加入4 mL75%乙醇溶液搅拌30 min，再加入0.2 g氢氧化钠剧烈搅拌50 min，向反应液中加入15 mg氯乙酸，在60 ℃反应3.5 h使其醚化，再加入0.08 g氢氧化钠及少量蒸馏水，冷却后用乙酸调pH至5.0；置于透析袋中透析3 d，将透析液浓缩，冻干。

1.3.1 取代度计算

称取羧甲基化红景天多糖10 mg，加入4 mL 0.2 mol/L HCI溶液(70%甲醇溶液配制)，磁力搅拌反应3 h，用80%甲醇溶液洗涤固体；样品再用40 mL 0.01 mol/L标准NaOH溶液溶解，加入适量甲基橙指示剂，立即用0.01 mol/L标准HCI溶液反滴定，直到滴定终点，记录加入盐酸的体积VHCI。

式中B为每克样品消耗NaOH物质的量，mmol/g；DS为取代度；W为样品质量；CNaOH=0.01 mol/L；CHCI=0.01 mol/L。

1.3.2 羧甲基化红景天多糖制备工艺优化[20-27]

以氯乙酸用量、反应温度和反应时间为红景天多糖羧甲基化制备工艺影响因素，采用三因素三水平正交实验优化制备工艺，正交实验因素与水平分别为反应温度(因素A)50、55、60 ℃，氯乙酸用量(因素B)10、15、20 mg，反应时间(因素C)2.5、3.0、3.5 h。

1.4 羧甲基化红景天多糖的红外光谱采集

称取干燥至恒重的脱色脱蛋白红景天多糖和羧甲基化修饰的红景天多糖各5 g，与干燥至恒重的溴化钾(KBr)按1:100混合，置于玛瑙研钵内研磨均匀；置于压片机中压制得到透明的薄片后，在4 000~400 cm-1范围内进行红外光谱扫描，分辨率为4 cm-1，测定红外光谱。

1.5 抗氧化活性测定 1.5.1 超氧阴离子自由基(O-2·)清除率测定

分别向试管中加入50 mmol/L Tris-HCI缓冲液(pH=8.2)4.5 mL，在25 ℃水浴中预热20 min，再分别加入1 mL不同浓度的(1、2、3、4、5 mg/mL)红景天多糖和羧甲基化红景天多糖溶液，25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，混匀，置于25 ℃水浴中反应5 min，再加入8 mol/L盐酸溶液1 mL终止反应，于299 nm处测定吸光(Ai)值，每个质量浓度做3个平行管，结果取平均值；对照组用1 mL蒸馏水代替多糖溶液，测其吸光(AO)值。清除率=[(AO-Ai)/AO]×100%。

1.5.2 2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2, 2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]自由基清除率测定

分别向试管中加人0.1 mL不同浓度(1、2、3、4、5 mg/mL)红景天多糖和羧甲基化红景天多糖，依次加入ABTS溶液5 mL，混匀，避光室温反应6 min, 在734 nm处测吸光度(A样品)值，每个质量浓度做3个平行管，结果取平均值；对照组采用0.1 mL蒸馏水代替多糖溶液，测其吸光度(A对照)值。清除率(%)=(1-A样品/A对照)×100%。

1.6 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析, 方差齐时组间比较采用最小显著差法，方差不齐时行Dunnet′S T3检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 正交实验分析与验证(表 1)
表 1 正交实验结果与分析

根据R值判定，3个因素对实验结果的影响顺序为反应温度 > 氯乙酸用量 > 反应时间，由k值可判断出最佳组合为A3B2C3；方差分析显示，在5%置信区间内，上述3个因素对红景天多糖羧甲基取代度影响差异无统计学意义(P > 0.05)。确定红景天多糖羧甲基化的最佳反应条件为：反应温度60 ℃、氯乙酸用量15 mg和反应时间3.5 h。在最佳条件下设置3个平行实验，其取代度结果分别为15.32、14.73、15.16，平均值为15.07，均优于其他组合，表明最佳优化条件合理可行。

2.2 羧甲基化红景天多糖红外光谱分析

羧甲基化红景天多糖与红景天多糖除具有一般多糖的特征性结构峰(在3 400 cm-1左右的强宽峰为-OH基团的O-H伸缩振动和N-H的伸缩振动；2 900 cm-1左右为-CH2基团的C-H伸缩振动)外，主要区别为：3 100 cm-1~3 660 cm-1之间的特征吸收峰明显减弱；1 640.56 cm-1为-C-O-的非对称伸缩振动，该吸收峰为强峰；1 420 cm-1为-C-O-对称伸缩振动，该吸收峰为中强峰；1 337.34 cm-1为O-H面内变角振动，该吸收峰为中强峰。而1 640.56 cm-1、1 420 cm-1和1 337.34 cm-1处的3个吸收峰为-COOH-基团的特征吸收峰，证明羧甲基取代成功，1 112.44 cm-1为C-O-C对称伸缩振动。

2.3 羧甲基化对红景天抗氧化活性影响 2.3.1 清除超氧阴离子自由基能力(图 1)
图 1 羧甲基化对红景天多糖超氧阴离子自由基清除能力影响

红景天多糖和羧甲基化红景天多糖对超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力，且清除率均随着多糖浓度增大而增强。在质量浓度为5 mg/mL时，红景天多糖和羧甲基化红景天多糖对超氧阴离子的清除率分别为21.34%和53.16%，经羧甲基化修饰后的红景天多糖相较红景天多糖对超氧阴离子自由基的清除能力明显增强。

2.3.2 清除ABTS自由基能力(图 2)
图 2 羧甲基化对红景天多糖ABTS自由基清除能力影响

结果显示，红景天多糖和羧甲基化红景天多糖对ABTS自由基均具有一定清除能力，且清除率均随着多糖浓度的增大而增强。在质量浓度为5 mg/mL时，红景天多糖和羧甲基化红景天多糖对ABTS自由基的清除率分别为23.29%和45.64%，经羧甲基化修饰后的红景天多糖对ABTS自由基的清除能力明显增强。

3 讨论

红景天中含有丰富的多糖，是天然的抗氧化剂，为提高多糖的生物活性，多糖的分子修饰及结构改造具有重要意义。本研究通过正交实验确定羧甲基化红景天多糖的最佳条件，得出最佳取代度为15.07。研究表明过量的超氧阴离子可以导致机体出现氧化损伤[28]。本研究结果显示，红景天多糖和经羧甲基化修饰后的红景天多糖均能有效清除超氧阴离子自由基和ABTS自由基，随着多糖质量浓度升高，清除能力逐渐增强；与红景天多糖比较，羧甲基化红景天多糖具有更好的抗氧化活性。这可能与羧甲基化修饰后，原来包裹的羟基被释放，增加了红景天多糖的溶解度和吸收率有关[29]，但具体作用机制尚不明确，是否与取代基团的个数、取代位置有关值得进一步深入研究。

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