阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是以记忆力损害和进行性认知障碍为主要症状的中枢神经系统退行性疾病，发病机制复杂。有研究表明，大脑皮质区及海马区中β淀粉样蛋白增多与沉积以及c-fos基因表达增多，可能是导致记忆、学习障碍的机制之一^[1]；c-fos是一种跨膜磷酸蛋白，参与脑功能活动的信号转导和调控，为接受刺激的神经元激活标志物，可用来确定神经元对伤害性刺激反应^[2]。被动和主动回避训练等多种学习记忆模型均可诱导脑内c-fos基因表达，某些药物也可影响c-fos基因表达，临床病例观察发现c-fos基因在多数老年痴呆患者脑内过表达^[3]。研究表明香菇多糖对小鼠免疫及内分泌功能均有影响^[4]。本研究通过观察香菇多糖对AD模型大鼠抗氧化作用、c-fos表达和学习记忆能力影响，探讨香菇多糖对AD大鼠的改善作用及机制。结果报告如下。

SPF级SD雄性大鼠50只，郑州大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(豫)2010-002；体重(235±25) g，饲养环境温度为20~26 ℃，颗粒鼠料喂养，自由饮水，湿度保持在50%~60%。

兔抗鼠c-fos多克隆抗体、链霉素复合物(streptavidin biotin complex，SABC)荧光显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)测试盒(南京建成生物工程研究所)，注射用香菇多糖(lentinan，LNT)(2 mg/支，南京绿叶思科药业有限公司)。Morris水迷宫及SM-2水迷宫控制仪(中国医学科学院药物研究所研制)，BX51/BX52系统OLYMPUS显微镜(奥林巴斯中国有限公司)，Eppendorf核酸蛋白分析仪(德国Eppendorf公司)，电泳凝胶成像系统(英国SynPBPe公司)，DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)。

随机抽取10只大鼠作为对照组，另40只大鼠腹腔注射1.2%D-半乳糖110 mg/kg和0.9%苯甲酸钠200 mg/kg，连续22 d，制造AD模型；第6天，进行Morris水迷宫实验，大鼠平均逃避潜伏期与对照组均值之差占该鼠的平均逃避潜伏期比值 > 20%则表示造模成功。随机抽取30只造模成功大鼠，再随机分为模型组、香菇多糖高、低剂量组(50、10 mg/kg)；香菇多糖组大鼠灌胃给予相应剂量的LNT，模型组和对照组大鼠灌胃等量生理盐水，每日1次，连续28 d。

采用水迷宫实验，每天将大鼠从4个象限依次放入水迷宫池内，让其自由游泳60 s初步适应水迷宫环境，每个象限间隔20 min。先后进行定位航行和空间探索试验, 定位航行试验5 d, 每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中各1次, 记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)；空间探索试验是在定位航行试验后去除平台，任选一个入水点将大鼠放入水池中, 记录其在120 s内的游泳轨迹, 考察大鼠对原平台的记忆。

将大鼠固定于冰上用0.9%NaCl灌注，快速断头，迅速冰上剥离脑组织，用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冰水中清洗，正中矢状面切开，冰台上剥离海马及大脑皮质，精密称重。一侧脑组织及海马加入9倍预冷的0.01 mol/L PBS，制备10%海马组织匀浆及大脑皮质匀浆。大脑皮质匀浆经离心，取上清液加入考马斯亮蓝G250，染料与蛋白质中NH₃⁺基团结合，使溶液变为蓝色，测定吸光度值计算组织匀浆中蛋白含量(考马斯亮蓝法)；采用试剂盒法测定CAT、SOD活力(U/mgpro)及MAO含量(nmol/100 mgpro)。

(1) 荧光抗体法：剥离另一侧脑组织置4%多聚甲醛溶液固定24 h，用蔗糖溶液4 ℃梯度脱水：先10%蔗糖沉底后再用15%蔗糖12 h，20%蔗糖12 h，最后用30%蔗糖12 h；用锡纸包好置于-70 ℃冰箱保存。细胞中出现棕黄色反应产物者为c-fos表达阳性，每组取5张切片，用显微照像系统对海马组织切片进行观察、照相，每张片取5个视野(×200)，统计阳性表达面积(%)和吸光度(A)值；应用荧光显微镜在395 nm紫外光激发光下观察，发现绿色荧光为c-fos阳性细胞；每只大鼠取3张切片于400倍镜下随机取5个不重叠视野观察c-fos阳性表达情况，进行定位分析。(2) Western blot法检测海马组织c-fos蛋白表达：取海马组织匀浆，置于4 ℃条件下离心20 min(18 000 r/min)，取上清液提取蛋白定量；取总蛋白(50 μg)在12% SDS-PAGE凝胶上电泳分离90 min，将蛋白恒流湿转载至硝酸纤维素(nitrocellulose, NG)膜上(80 min，恒压100 V)；取出NG膜清洗后浸泡在5%脱脂奶粉溶于TBST(Tris-base 0.05 mol/L，氯化钠8.5 g/L，0.1%聚山梨酯20，浓盐酸调pH至7.5) 封闭液封闭1 h。一抗溶于1%脱脂奶粉的TBST，4 ℃过夜孵育；用TBST洗膜后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1：10 000)，室温条件下孵育1 h；再次洗膜后，加荧光剂，压片显影，定影，曝光，洗片；用Image J 5.0软件读片。

计量资料以x±s表示，应用SPSS 18.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法, 检验水准为α=0.05。

表 1

表 1 香菇多糖对AD大鼠逃避潜伏期影响(s，x±s，n=10) 组别(mg/kg) 训练时间(d) 1 3 5 对照组 35.65±9.34 27.58±6.53 25.82±5.45 模型组 66.73±8.60a 68.39±6.52a 63.67±5.19a 香菇多糖组 10 59.16±7.86a 47.38±4.73b 41.64±7.51b 50 56.54±6.76a 41.79±4.03c 35.67±4.68c   注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.05；c P < 0.01。

表 1 香菇多糖对AD大鼠逃避潜伏期影响(s，x±s，n=10)

与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期均明显延长(P < 0.01)，表明AD模型复制成功。与模型组比较，香菇多糖组大鼠训练第3、5 d逃避潜伏期明显缩短(P < 0.05)。

表 2

表 2 香菇多糖对AD大鼠空间探索能力影响(x±s，n=10) 组别 (mg/kg) 跨越平台次数 目标象限停留时间(s) 对照组 5.73±1.45 49.53±10.80 模型组 2.09±1.22a 18.46±10.98a 香菇多糖组 10 4.31±1.04b 31.64±9.67b 50 4.89±1.01b 39.42±9.73b   注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01。

表 2 香菇多糖对AD大鼠空间探索能力影响(x±s，n=10)

与对照组比较，模型组大鼠单位时间内跨越原平台次数与目标象限停留时间均减少，差异有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，香菇多糖组大鼠单位时间内跨越原平台次数与目标象限停留时间均明显延长(P < 0.01)。

表 3

表 3 香菇多糖对AD大鼠大脑皮质CAT、SOD活力和MAO含量影响(x±s，n=10) 组别 (mg/kg) CAT (U/mgpro) SOD (U/mgpro) MAO (nmol/100 mgpro) 对照组 8.11±1.74 14.23±2.78 31.16±6.82 模型组 4.98±1.32a 9.39±2.52a 68.62±9.67a 香菇多糖组 10 6.74±0.97b 11.98±1.79b 41.08±6.34b 50 7.18±1.19b 13.45±2.21b 38.33±6.53b   注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01。

表 3 香菇多糖对AD大鼠大脑皮质CAT、SOD活力和MAO含量影响(x±s，n=10)

与对照组比较，模型组大鼠大脑皮质CAT及SOD活力明显下降、MAO含量明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，香菇多糖组大鼠大脑皮质CAT及SOD活力明显升高、而MAO含量明显减少(P < 0.01)。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C、D：低、高剂量香菇多糖组。 图 1 香菇多糖对AD大鼠海马c-fos表达影响(荧光抗体法，×200)

荧光显微镜观察显示，对照组大鼠海马区可见少量绿色荧光，c-fos抗体荧光表达阳性细胞数较少(图 1A)；模型组大鼠海马区可见明显绿色荧光，c-fos阳性细胞聚集或散在分布于海马齿状回颗粒细胞层，阳性细胞数较多(图 1B)；与模型组比较，低剂量香菇多糖组c-fos阳性细胞数减少不明显(图 1C)；高剂量香菇多糖组c-fos阳性细胞数明显减少(图 1D)。

图 2

注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.01。 图 2 香菇多糖对AD大鼠海马c-fos表达影响(Western blot法)

对照组大鼠海马组织c-fos蛋白表达处于较低水平；与对照组比较，模型组大鼠海马c-fos蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，香菇多糖组大鼠c-fos蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P < 0.01)。

阿尔茨海默病的认知功能减退、人格异常和日常行为能力下降等，不仅影响自身的生活质量，也对患者家庭造成很大负担。对家庭造成的不仅是经济负担，更重要的是精神压力，从而影响社会功能^[5]。本研究结果显示，模型组大鼠逃避潜伏期明显长于对照组，表明其短期记忆严重受损；自训练的第3天开始香菇多糖组大鼠目标象限探索能力明显高于模型组，大鼠在原平台所在象限逗留时间明显延长，单位时间内跨越原平台次数明显增多。提示，香菇多糖具有一定改善学习记忆能力的作用。

AD可由多种原因引起，发病机制复杂^[6]。有研究认为：氧化应激反应在AD的发病过程中扮演重要角色^[7]，氧化应激反应能上调早老素1和Aβ分泌酶表达，使细胞中有害代谢产物大量积累, 如一些自由基和超氧阴离子(O^2-)。抗氧化作用则能避免细胞在生物氧化产生这些代谢产物时受到伤害。如SOD能够将超氧阴离子歧化成无害的氧气和氧离子，清除一些自由基，从而能够延缓细胞衰老^[8]。本研究结果显示，香菇多糖可增强大鼠大脑皮质CAT、SOD抗氧化酶活力并减低MAO含量，提高机体总体抗氧化能力，从而减轻氧化应激反应对细胞的伤害。

阿尔茨海默病相关神经丝蛋白c-fos不仅具有促进直肠癌细胞生长和抑制调亡作用^[9]，并且在AD患者的神经元纤维缠结中大量存在，呈分泌性上调表达，推测它可能与AD的病理过程有关^[10-11]。AD患者脑内可见c-fos免疫阳性反应条带，c-fos存在于AD患者的尿液和脑脊液中，且随病程延长含量逐渐升高，痴呆程度与c-fos含量呈正相关^[12-13]，AD患者脑脊液中c-fos的平均浓度是正常对照组的6倍^[14]。本研究结果表明对照组大鼠海马区可见少量绿色荧光，c-fos阳性细胞数较少, 而模型组大鼠海马区c-fos阳性细胞广泛分布；与模型组比较，香菇多糖组大鼠海马组织中c-fos阳性细胞数明显下降；Western blot结果表明香菇多糖可明显下调AD大鼠海马组织中c-fos的表达。提示，香菇多糖对AD模型大鼠的学习记忆能力具有一定改善作用，其机制可能与增强AD模型大鼠大脑抗氧化作用、下调c-fos在海马中的表达有关。