外源性限制血管生成可明显抑制肿瘤生长，甚至使肿瘤消退。因此，血管生成抑素对于肿瘤的治疗提供了一个重要的新方法^[1]。但由于血管生成抑素治疗需要高浓度、提取过程复杂，应用受限，而基因治疗可在一定程度上解决这个难题。肿瘤抑素(tumstatin)是一种新型高效的内源性血管内皮细胞生长抑制因子^[2]，其抗血管生成作用比血管内皮抑素强10倍^[3]。Tum-5由tumstatin接近N端的54~132位氨基酸组成，是tumstatin的抗血管生成活性区，Tum-5与全长tumstatin具有同等的抗血管生成效能^[4]。前期研究已成功构建pLXSN-Tum-5重组体^[5-6]。本研究以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)为对象，观察逆转录病毒载体-Tum-5，即pLXSN-Tum-5病毒颗粒对细胞增殖、凋亡影响，通过观察B cell lymphoma 2 (Bcl-2)、Bcl-2-associated X (Bax)、caspase-3在mRNA和蛋白表达水平变化，探讨Tum-5基因对HUVEC增殖的影响及机制。

HUVEC由吉林大学病理生理学教研室馈赠；DMEM(Dulbecco′s modified Eagle medium)培养基(长春博德生物制品公司)；小牛血清(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑[3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)和Hoechst-33342(美国Sigma公司)；pLXSN-Tum-5和pLXSN病毒颗粒由北华大学医学实验中心提供，滴度分别为8.6×10⁶和7.2×10⁶ cfu/mL；PCR引物合成和质粒测序(上海生物工程技术服务公司)；RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒(天津生化科技有限公司)；β-actin、Bcl-2、Bax和Caspase-3抗体(美国Santa Cruz公司)。PLUS384型全自动酶标仪(美国MDC公司)；DNA蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司)；Image-Pro Plus图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司)。

复苏HUVEC，加入含10%小牛血清DMEM培养基混匀后置于25 cm²培养瓶中，将培养瓶置于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养，隔日换液1次；收集处于对数生长期的细胞用于实验。

采用MTT法，消化收集细胞，配制细胞悬液为1×10⁴个/mL，取96孔细胞培养板，每孔中加100 μL细胞悬液培养过夜；采用pLXSN-Tum-5病毒颗粒2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μL/mL感染HUVEC，pLXSN病毒颗粒为对照组，每组设6个复孔；在37 ℃、5%CO₂环境中培养24 h；每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h后弃掉培养液，每孔加DMSO 150 μL，置室温10 min，使结晶物充分融解；在570 nm波长处采用酶标仪检测各孔吸光度(A)值，抑制率=[1-(A_实验组-A_空白组)/(A_对照组-A_空白组)]×100%。

将盖玻片在1%盐酸和70%乙醇溶液中浸泡30 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS)中洗3次，高压灭菌后将盖玻片置于24孔培养板内；按2×10³个/孔密度将细胞接种于24孔培养板中，采用0.0、5.0、10.0和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染HUVEC，每组设3个复孔；培养24 h后弃培养液，加入固定液(甲醇：冰醋酸为3：1)，室温固定30 min；PBS洗2次，加入Hoechst-33324染色液0.5 mL，染色10 min；PBS洗3次，激光共聚焦显微镜下观察(800×)，并拍照记录。

采用real-time reverse transcription PCR (RT-PCR)法，分别用0.0、5.0、10.0和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染HUVEC 24 h，Trizol试剂盒提取总RNA，反转录制备cDNA，用Bcl-2、Bax、Caspase-3和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物进行PCR扩增；Caspase-3引物：上游：5′-TCTGACTGGAAAGCCGAAAC-3′，下游：5′-CTGGATGAACCACGACCC-3′，长度202 bp，退火温度54 ℃；Bax引物：上游：5′-AGGGTTTCATCCAGGATCGAGC-3′，下游：5′-AGGCGGTGAGGACTCCAGCC-3′，长度468 bp，退火温度58 ℃；Bcl-2引物：上游：5′-GAAGATCTAGGA TGGCGCACGCTTG-3′，下游：5′-CGGAATTCTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′，长度723 bp，退火温度64 ℃；GAPDH引物：上游：5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游为：5′-AAGAATGGGTGT TGCTGTTGAAGTC-3′，长度617 bp，退火温度58 ℃；扩增条件为：变性为94 ℃ 5 min；复性45 s，延伸为72 ℃ 45 s，30个循环后将得到的PCR产物进行琼脂糖电泳分析，凝胶成像系统下观察并拍照，实验重复3次。

采用Western blot法，分别用0.0、5.0、10.0、和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5病毒颗粒感染HUVEC 24 h，提取各组细胞总蛋白，Bio-Rad法测定蛋白含量；取总蛋白15 μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)、转膜，5%脱脂奶封闭2 h，一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3，1：1 000)4 ℃摇床过夜。次日加入二抗(1：1000) 摇床上室温反应2 h；洗膜后二氨基联苯(3，3′-diaminobenzidine，DAB)显色液(5 mg DAB粉末加入10 mL蒸馏水，再加8~10 μL 30% H₂O₂，使用前配制)显色，目标条带清晰后中止显色、拍照和记录。

数据均以(x±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间均数比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

不同浓度pLXSN-Tum-5作用于HUVEC细胞时，对照组、5.0、10.0、20.0和40.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC细胞存活率分别为(100.00±0.24)%、(96.56±2.78)%、(87.42±2.87)%、(60.29±3.02)%、(60.29±3.02)%和(59.42±3.07)%；与对照组比较，5.0、10.0、20.0和40.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC细胞存活率明显下降，差异均有统计学意义(P < 0.05)，呈剂量效应关系。

图 1

注：A：对照组；B、C、D：5.0、10.0、20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组。 图 1 pLXSN-Tum-5对HUVEC细胞凋亡影响(Hoechst-33342染色，800×)

对照组细胞核形态呈圆形，染色质在核内均匀分布，呈现均匀蓝染(图 1A)；5.0、10.0和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5转染组HUVEC细胞核呈不同程度浓集，呈亮蓝色，部分呈现核碎片、细胞核折缝样，大部分染色质出现浓缩状态和边缘化状态，可见凋亡小体(图 1B、C、D)。

图 2

注：1：对照组；2~4：5.0、10.0、20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组。 图 2 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡基因表达影响

表 1

表 1 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡基因表达影响(x±s，n=3) 组别(μL/mL) Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Caspase-3 对照组 0.562±0.031 8 0.779±0.027 3 0.721±0.041 2 0.654±0.034 5 pLXSN-Tum-5组 5.0 0.778±0.036 4a 0.853±0.021 6a 0.912±0.039 7a 0.791±0.061 2 10.0 0.958±0.063 1a 1.035±0.038 3a 0.925±0.041 5a 0.912±0.051 3a 20.0 1.218±0.067 2a 1.074±0.045 8a 1.134±0.052 4a 1.012±0.064 1a   注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 1 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡基因表达影响(x±s，n=3)

与对照组比较，5.0、10.0和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC内Bax mRNA表达水平增加，Bax/Bcl-2比值明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05)；与对照组比较，10.0、20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC内caspase-3 mRNA表达水平明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 3

注：1：对照组；2~4：5.0、10.0、20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组。 图 3 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡蛋白表达影响

表 2

表 2 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡因子表达影响(x±s，n=3) 组别(μL/mL) Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 caspase-3 对照组 1.238±0.048 1.294±0.024 0.956±0.032 0.356±0.0541 pLXSN-Tum-5组 5.0 1.556±0.063a 1.185±0.037a 1.312±0.051a 0.412±0.0449 10.0 1.685±0.071a 1.162±0.049a 1.450±0.065a 0.512±0.0497a 20.0 1.824±0.066a 1.131±0.039a 1.612±0.067a 0.712±0.0647a   注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 2 pLXSN-Tum-5对HUVEC中凋亡因子表达影响(x±s，n=3)

Western blot结果显示，与对照组比较，随着pLXSN-Tum-5浓度增加，5.0、10.0和20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2水平下降，Bax/Bcl-2比值升高，差异有统计学意义(P < 0.05)；与对照组比较，10.0、20.0 μL/mL pLXSN-Tum-5组HUVEC内caspase-3蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。

肿瘤生长、转移和复发所需的氧气和营养物质必须从肿瘤的新生血管中获得。研究表明，大于1 mm³肿瘤在得不到血液供应时，肿瘤细胞就会发生休眠、坏死或凋亡^[7-10]。抑制新生血管的生成无疑是一种简单而有效的治疗策略。肿瘤抑素(tumstatin)是继血管生成抑素(angiostatin)和血管内皮抑素(endostatin)之后发现的源于人基膜胶原Ⅳ的血管生成的抑制因子，可有效抑制人内皮细胞的增生，引起内皮细胞凋亡，抑制新生血管的生成，达到抗肿瘤生长的目的^[11]。Tum-5是肿瘤抑素的抗血管生成活性片段，与全长肿瘤抑素具有相同的抗血管活性^[4]。

本研究结果显示，随着pLXSN-Tum-5病毒颗粒浓度增加，HUVEC存活率呈剂量依赖性地下降；细胞核呈不同程度浓集，呈亮蓝色，可见核碎片，染色质出现浓缩和边缘化状态，产生凋亡小体，细胞凋亡率明显增加。本研究结果还显示，pLXSN-Tum-5可明显上调HUVEC内Bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达水平，下调Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平，Bax/Bcl-2比值升高。提示，pLXSN-Tum-5可诱导HUVEC发生凋亡，其机制可能与上调凋亡相关基因、下调抗凋亡基因，最终使促凋亡基因及蛋白比值增加，激活下游的凋亡效应蛋白caspase-3表达，致细胞发生凋亡有关。