2017, Vol. 33
2. 上海市计划生育科学研究所;
3. 济宁医学院公共卫生学院;
4. 天津医科大学公共卫生学院
先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)是由胎儿时期心脏及大血管发育异常所导致的先天性畸形，调查显示活产儿CHD发病率高达6‰~10‰[1]。监测数据显示中国围生期CHD发生率整体呈上升趋势，且在2011年位于围生期出生缺陷首位[2]。目前认为多数CHD是遗传因素与环境因素共同作用所致的多基因疾病，但确切病因尚未明确[3-4]。有研究表明，母亲孕期暴露于环境化学物质可增加新生儿出生缺陷的发生风险, 而外源性化学物质在体内转化第一时相最主要的代谢酶为细胞色素P450(CYP450)，其基因的多态性决定了代谢酶的活性与功能的重要性[5-6]，携带不同代谢酶基因型与子代出生结局如早产、出生缺陷的发生风险存在关联。CYP1A1是CYP450家族的主要成员之一，有研究表明，母亲孕期吸烟或被动吸烟，如同时携带CYP1A1可增加早产等结局的发生风险[7-8]。为探讨子代CYP450基因多态性及母亲孕期环境危险因素暴露与CHD发病的关系以及二者在CHD发生中是否存在交互作用，本研究采用病例对照研究方法对2011年10月—2013年1月在山东省济宁医学院第一附属医院确诊的160例0~7周岁单纯性CHD患儿和同期在该院进行体检或就诊的160例非心脏病幼儿分别作为病例组和对照组，应用单因素和多因素条件logistic回归模型分析子代CYP450基因多态性及母亲孕期环境危险因素暴露与CHD发病的关联强度，并采用相加模型交互作用指标评价二者的交互作用。结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象采用以医院为基础的病例对照研究方法，将2011年10月—2013年1月在山东省济宁医学院第一附属医院确诊的160例0~7岁单纯性CHD患儿作为病例组；选择同期在该院进行体检或就诊的160例非心脏病幼儿作为对照组。病例组患儿均为经彩色多普勒超声或手术确诊且排除心脏血管之外的其他畸形者；对照组儿童按病例组患儿的性别、年龄(±8个月)进行1:1匹配，且均无遗传性疾病和出生缺陷。所有研究对象父母亲均为汉族，居住在济宁、菏泽等鲁西南地区。本次调查时均与研究对象签署了知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 问卷调查采用自行设计调查表，由经过统一培训的调查员对研究对象母亲进行面访调查。内容包括幼儿性别、年龄、出生体重、出生胎龄等幼儿基本情况，母亲孕龄、产次、文化程度、职业等母亲基本情况以及母亲孕前3个月、孕期被动吸烟史、环境化学物质接触史(农药、祛斑美白产品、染发剂、装修过的居室、居住点周围工厂)、用药史(解热镇痛药、抗生素、保胎药)和孕早期有无发热等。其中，被动吸烟指1周内有≥1 d吸入吸烟者呼出烟雾的时间≥15 min[9]。
1.2.2 DNA提取和基因型检测(1) DNA提取：抽取研究对象清晨空腹静脉血3 mL，以4 000 r/min、15 min离心分离血清和血凝块，吸出血清后，将血凝块置-80 ℃低温冰箱保存。采用大连天根生化有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)，将血凝块捏碎、裂解、离心后提取细胞核沉淀，再经蛋白酶溶液、RNA溶液处理后多次吸附柱处理，加入缓冲液溶解后置于-20 ℃冰箱储存备用。详细步骤见文献[10]。(2) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)：应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(polymerase chain reaction restricted fragment length polymorphism，PCR-RFLP)检测CYP450基因CYP1A1 rs1048943、rs4646903和CYP2E1 rs3813867、rs2031920以及CYP2D6 rs16947、rs1065852位点多态性。参照文献应用软件premier 5.0设计六对引物[11-13]，由上海捷瑞生物工程公司合成。CYP1A1 rs1048943引物上游：5′-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3′，下游：5′-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3′，长度340 bp；CYP1A1 rs4646903引物上游：5′-TGATGGTGCTATCGACAAGG-3′，下游：5-AGGCATGCTTCAT-CCTTAGC-3′，长度340 bp；CYP2E1 rs3813867引物上游：5′-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3′，下游：5′-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3′，长度410 bp；CYP2E1 rs2031920引物上游：5′-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3′，下游：5′-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3′，长度410 bp；CYP2D6 rs16947引物上游：5′-GCTACCCCGTTCTGTCCCGA-3′，下游：5′-GTGGTCACCATCCCGGCAG-3′，长度210 bp；CYP2D6 rs1065852引物上游：5′-CCATTTGGTAGTGAGGCAGGTAT-3′，下游：5′-CACCATCCATGTTTGCTTCTGGT-3′，长度260 bp。(3) DNA测序：采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，取1.5 μL PCR产物经0.1 U虾碱性磷酸酶(瑞士罗氏公司)和0.5U核酸外切酶Ⅰ(美国NEB公司)消化处理。步骤如下：37 ℃消化45 min，85 ℃灭活20 min，然后采用BigDye终止子循环测序试剂进行测序反应，最后使用美国ABI公司的3130X型基因分析仪进行测序分析。
1.3 统计分析采用Epi Data 3.1软件建立数据库，应用SAS 9.3统计软件进行一般描述性分析、χ2检验以及单因素和多因素条件logistic回归分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。根据Rothman等[14-15]提出的基于相加模型的3个评价相加交互作用的指标及其可信区间，对基因和环境危险因素暴露间可能存在的相加交互作用进行定性判断和定量分析及显著性检验。(1) 超额相对危险度(relative excess risk of interaction, RERI)：表示两因素联合作用与其单独作用之和的差值。如果两因素间存在相加的交互作用，则RERI可信区间不应包括0。(2) 交互作用归因比(attributable proportion due to interaction, AP)：表示总效应中有多大比例归因于两因子交互作用。如果两因子间存在相加的交互作用，则AP可信区间不应包括0。(3) 交互作用指数(synergy index, S)：当S=1时，无交互作用；S＞1时，两因子之间有正交互作用；S < 1时，两因子间有负交互作用。如果两因素间存在相加的交互作用，则S可信区间不应包括1。
2 结果 2.1 一般情况160例病例组CHD患儿中，男童85例(53.1%)，女童75例(46.9%)；年龄 < 1岁36例(22.5%)，1岁~62例(38.7%)，3岁~39例(24.4%)，≥5岁23例(14.4%)；出生体重 < 2 500 g 13例(8.1%)，2 500~3 999 g 130例(81.3%)，≥4 000 g 16例(10.0%)，不详1例(0.6%)；出生胎龄 < 37周30例(18.8%)，≥37周121例(75.6%)，不详9例(5.6%)；母亲孕龄 < 20岁6例(3.7%)，20~34岁142例(88.8%)，≥35岁12例(7.5%)；母亲产次1次48例(30.0%)，≥2次112例(70.0%)；母亲文化程度小学及以下41例(25.6%)，初中85例(53.1%)，高中23例(14.4%)，大专及以上6例(3.8%)，不详5例(3.1%)；母亲职业为脑力劳动者6例(3.8%)，体力劳动者110例(68.7%)，其他44例(27.5%)。160例对照组幼儿中，男童85例(53.1%)，女童75例(46.9%)；年龄 < 1岁36例(22.5%)，1岁~61例(38.1%)，3岁~38例(23.8%)，≥5岁25例(15.6%)；出生体重 < 2 500 g 5例(3.1%)，2 500~3 999 g 139例(86.9%)，≥4 000 g 14例(8.8%)，不详2例(1.2%)；出生胎龄 < 37周9例(5.6%)，≥37周141例(88.1%)，不详10例(6.3%)；母亲孕龄 < 20岁5例(3.1%)，20~34岁143例(89.4%)，≥35岁12例(7.5%)；母亲产次1次53例(33.1%)，≥2次107例(66.9%)；母亲文化程度小学及以下21例(13.1%)，初中81例(50.6%)，高中37例(23.1%)，大专及以上20例(12.5%)，不详1例(0.6%)；母亲职业为脑力劳动者12例(7.5%)，体力劳动者67例(41.9%)，其他79例(49.4%)，不详2例(1.2%)。2组幼儿一般情况比较，病例组与对照组幼儿出生体重、幼儿出生胎龄、母亲文化程度和母亲职业分布差异均有统计学意义(均P < 0.05)，幼儿性别、幼儿年龄、母亲产次和母亲文化程度差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
2.2 子代CYP450基因不同SNP位点多态性与CHD发病关系(表 1)
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表 1 子代CYP450基因不同SNP位点多态性与CHD发病关系 |
单因素和多因素条件logistic分析结果均显示，子代CYP1A1基因rs1048943位点纯合子突变型是CHD发病的保护因素。CYP1A1 rs4646903和CYP2E1 rs3813867、rs2031920以及CYP2 D6rs16947、rs1065852位点携带纯合子突变与非纯合子突变基因型在病例组与对照组之间分布频率差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
2.3 母亲孕期环境危险因素暴露与CHD发病关系(表 2)|
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表 2 母亲孕期环境危险因素暴露与CHD发病关系 |
单因素条件logistic回归分析结果显示，母亲孕前3个月使用染发剂、孕前3个月被动吸烟、孕早期被动吸烟、孕早期居住在3年内装修过的居室、孕前3年内及孕期居住点周围有工厂和孕早期服用解热镇痛药是CHD发病的危险因素；在调整了幼儿出生体重、幼儿出生胎龄、母亲文化程度和母亲职业等混杂因素后，多因素条件logistic回归分析结果显示，母亲孕前3个月使用染发剂、孕前3个月被动吸烟、孕早期被动吸烟、孕早期居住在3年内装修过的居室和孕早期服用解热镇痛药是CHD发病的危险因素。
2.4 子代CYP1A1基因rs1048943位点多态性与母亲孕期环境危险因素暴露对CHD发病的交互作用(表 3)|
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表 3 子代CYP1A1基因rs1048943位点多态性与母亲孕期环境危险因素暴露对CHD发病的交互作用 |
将研究对象CYP1A1基因rs1048943位点多态性以及母亲孕前3个月使用染发剂、孕前3个月被动吸烟、孕早期被动吸烟、孕早期居住在3年内装修过的居室、孕前3年内及孕期居住点周围有工厂在不同暴露情况下的OR值分别带入交互作用相加模型，计算交互作用指标值。结果显示，CYP1A1纯合子突变基因型有减弱孕前3个月被动吸烟、孕早期居住在3年内装修过的居室、孕前3年内及孕期居住点周围有工厂3个环境因子致病风险的趋势，但是交互作用指标差异均无统计学意义。
3 讨论本研究结果显示，子代携带CYP1A1基因rs1048943位点纯合子突变型对CHD的发病有保护作用，而母亲孕期环境危险因素暴露则增加了子代CHD发病的风险。交互作用分析结果显示，子代携带CYP1A1 rs1048943位点纯合子突变型有减弱环境因素致病风险的趋势，但交互作用指标无统计学意义。
CYP450是一个单氧化酶家族，为人体内最主要的Ⅰ相代谢酶，能够催化大量的外源性和内源性化合物的代谢，参与致畸物和致癌物的活化过程。CYP1A1是CYP450家族成员之一，编码基因具有多态性导致其表达产物往往具有不同的生物学活性，能引起个体对疾病易感性的差异。NCBI数据库报道人类CYP1A1基因有212个SNP位点，其中rs1048943(A4889G)可能与CYP1A1酶的表达活性有关[16]。目前的研究显示母亲携带不同CYP1A1基因型与早产和低出生体重等的发生风险相关[7, 17]，但未检索到CYP1A1基因型与CHD的关联性研究。本研究发现对照组携带CYP1A1纯合子变异基因型的频率明显高于病例组，CYP1A1基因纯合子突变型表现为CHD发病的保护因素(OR=0.369)。CYP1A1基因型在外显子7中发生A→G的变异，且变异发生在酶蛋白的血红素结合区，导致酶活性较正常基因表达升高[18]。但CHD的发病机制和外源性化学物质在体内的生物转化过程均极其复杂，该突变型保护作用的发生机制尚有待进一步研究。
目前CHD的发病病因尚不明确，且影响胎儿心脏发育的危险因素较多，因此目前普遍观点认为CHD是遗传基因和环境危险因素相互作用的结果[19]。本研究结果显示，CYP1A1纯合子突变基因型可以减弱母亲孕前3个月被动吸烟、孕早期居住在3年内装修过的居室、孕前3年内及孕期居住点周围有工厂等因素的致病效应。当该基因型与上述环境危险因素暴露共同存在时，环境因素暴露引发CHD的危险性降低，但交互作用差异无统计学意义。在目前探讨CHD发病因素的研究中，有关CYP1A1基因多态性联合母亲孕期环境因素暴露的交互作用的报道较少。王宏宇[20]将CYP1A1基因多态性与孕期被动吸烟暴露史联合作用分析，也未发现显著性关联。这可能与研究的样本量较少，因而未能有足够的效能检验因子间的交互作用有关，今后将进一步扩大样本量进行相关研究。
综上所述，子代携带CYP1A1纯合子突变基因型对CHD的发病呈现出保护效应，而孕前3个月接触及孕早期被动吸烟、孕早期服用解热镇痛药、孕前3个月使用染发剂和孕早期居住在3年内装修过的居室则增加了子代CHD的发生风险，为进一步研究CHD的发生机制提供了新的研究线索。子代CYP1A1基因多态性和母亲上述孕期危险因素之间可能存在负相加交互作用，但是需要开展较大样本量的研究进一步验证。
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