镧是轻稀土元素的代表，可经呼吸道、消化道等途径进入机体，并在脑组织中蓄积，包括大脑皮质、海马和小脑，可引起学习与记忆能力缺陷^[1-3]。海马是学习记忆的关键脑区，近期研究发现海马在阿尔茨海默病早期即受到影响，出现年龄相关的血脑屏障破坏，且随轻度认知障碍而加重^[4]。研究表明，镧所致学习记忆能力下降可能与海马神经细胞核转录因子-κB活性降低^[5]，脑源性神经营养因子蛋白表达下调^[6]有关。而关于镧对海马血脑屏障完整性或功能影响的研究较少。本研究通过建立大鼠出生至断乳后1个月氯化镧暴露动物模型，观察仔鼠海马紧密连接蛋白表达和基因转录水平的变化，旨在探讨镧对仔鼠海马血脑屏障通透性的影响。结果报告如下。

60只清洁级Wistar大鼠，雌雄比例2:1，由中国医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(辽)2013-0001，体重(240±10) g；实验动物室温度(23 ± 1)℃，相对湿度(50 ± 5)%，照明周期12 h:12 h；动物适应性喂养1周后开始实验。

JY96-ⅡN型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Sigma 3k15型低温高速离心机(德国Sigma公司)，Mini P-4小型垂直电泳槽、Mini P-4小型Trans-Blot转印槽、Power BC高电流电泳电源(北京凯元信瑞仪器有限公司)，Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)，Roche LightCycler^® 480实时荧光定量PCR系统(德国Roche公司)。LaCl₃(分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司)，Trizol(分析纯)、引物、TaKaRa反转录试剂盒(RR047A)、TaKaRa荧光定量PCR试剂盒(DRR081A)(中国大连宝生物工程有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒、超敏增强化学发光试剂盒(南通碧云天生物技术有限公司)，兔抗claudin-5一抗(美国Abcam公司)，兔抗occludin一抗、兔抗紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1) 一抗(美国Zymed公司)，小鼠抗磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(美国Proteintech公司)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记二抗(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

40只雌性大鼠随机分为对照组和低、中、高剂量氯化镧组，按照雌雄比例2:1进行交配，次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者视为受孕成功，记为妊娠0 d。动物自由进食饮水，分娩后，各组孕鼠分别饮用蒸馏水，0.25%、0.5%、1.0% LaCl₃溶液，仔鼠断乳前经由吸吮母乳染镧，断乳后则继续饮用原浓度LaCl₃溶液，至断乳后1个月结束。每组随机选择3只母鼠，8只仔鼠雌雄各半进行各项指标测定。

染毒结束后，各组仔鼠称量体重，10%水合氯醛腹腔注射(4 mL/kg)麻醉，迅速断头取脑，称取全脑重，冰上迅速分离海马组织并称重，由海马重/体重计算得海马系数。

采用Western blot法，提取海马组织总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白含量测定；将样品调至相同浓度，95 ℃煮沸5 min变性，冰上冷却；取总量相同蛋白经10%(>200 kDa)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，湿转至聚偏氟乙烯膜(millipore，0.45μm)，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，兔抗claudin-5(1:1 000)、兔抗occludin(1:250)、兔抗ZO-1(1:250)、小鼠抗GAPDH(1:5 000)。洗膜缓冲液(Tris buffered saline tween，TBST)洗膜10 min × 3次，加入山羊抗兔或抗小鼠IgG(1:3 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，增强化学发光法显影。采用ImageJ软件分析，记录灰度值，进行定量分析。

采用real-time PCR法，Trizol法提取海马组织总RNA，定量并调浓度至500 ng/μL；参照试剂盒说明书进行反转录和real-time PCR；所用引物序列如表 1。以GAPDH基因作为内参，mRNA表达水平采用2^-ΔΔCT法表示。

表 1

表 1 Real-time PCR所用引物序列 基因名称 引物序列 片段长度(bp) Cldn5 上游 5′-TTCATCGGTGAAGTAGCCACCA-3′ 80 下游 5′-GACATTAAGGCAGCATCCAGCA-3′ Ocln 上游 5′-GTCTTGGGAGCCTTGACATCTTG-3′ 174 下游 5′-GCATTGGTCGAACGTGCATC-3′ Tjp1 上游 5′-CCATCTTTGGACCGATTGCTG-3′ 123 下游 5′-TAATGCCCGAGCTCCGATG-3′ Gapdh 上游 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′ 200 下游 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′

表 1 Real-time PCR所用引物序列

实验数据以x±s表示。采用SPSS 17.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)进行组间差异检验，两两比较采用SNK-q和Dunnet-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

与对照组比较，各剂量氯化镧组仔鼠体重均明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；呈剂量-效应关系(P＜0.05)。与对照组比较，各剂量氯化镧组仔鼠海马系数无明显变化。

表 2

表 2 染镧对仔鼠体重和海马系数影响(x±s，n=8) 组别(%) 体重(g) 海马系数(%) 对照组 196.75 ± 6.78 0.086 ± 0.008 氯化镧0.25 182.75 ± 4.56a 0.092 ± 0.014    0.50 170.50 ± 6.35ab 0.091 ± 0.015    1.00 155.88 ± 2.90abc 0.090 ± 0.010  注：与对照组比较，a P＜0.05；与0.25%氯化镧组比较，b P＜0.05；与0.50%氯化镧组比较，c P＜0.05。

表 2 染镧对仔鼠体重和海马系数影响(x±s，n=8)

随LaCl₃剂量升高，claudin-5和occludin蛋白表达逐渐降低；与对照组比较，0.50%和1.00%氯化镧组仔鼠海马中claudin-5和occludin蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；且1.00%氯化镧组仔鼠海马中claudin-5蛋白表达明显低于0.25%氯化镧组(P＜0.05)。

图 1

注：1：对照组；2~4：0.25%、0.50%、1.00%氯化镧组。 图 1 染镧对仔鼠海马紧密连接蛋白表达影响

表 3

表 3 染镧对仔鼠海马紧密连接蛋白表达影响(x±s，n=4) 组别(%) claudin-5 occludin ZO-1 对照组 0.088 ± 0.006 0.121 ± 0.016 0.091 ± 0.009 氯化镧0.25 0.069 ± 0.006 0.108 ± 0.010 0.090 ± 0.013    0.50 0.059 ± 0.007a 0.085 ± 0.004a 0.088 ± 0.008    1.00 0.041 ± 0.003ab 0.067 ± 0.004a 0.079 ± 0.015  注：与对照组比较，a P＜0.05；与0.25%氯化镧组比较，b P＜0.05。

表 3 染镧对仔鼠海马紧密连接蛋白表达影响(x±s，n=4)

与对照组比较，1.00%氯化镧组仔鼠海马中Cldn5 mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 4

表 4 染镧对仔鼠海马Cldn5、Ocln和Tjp1 mRNA表达影响(x±s，n=4) 组别(%) mRNA level (relative fold) Cldn5 Ocln Tjp1 对照组 1 1 1 氯化镧0.25 1.213 ± 0.029 1.091 ± 0.075 0.972 ± 0.179    0.50 0.975 ± 0.047 1.050 ± 0.125 0.914 ± 0.109    1.00 0.743 ± 0.026a 0.900 ± 0.119 0.931 ± 0.100  注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 4 染镧对仔鼠海马Cldn5、Ocln和Tjp1 mRNA表达影响(x±s，n=4)

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是存在于大脑实质和系统循环之间的界面，调控营养物质、离子和其他分子进入脑，保护脑组织免受毒物损伤，对正常脑功能的维持至关重要。无窗孔的脑微血管内皮细胞层是BBB的首要结构，并通过紧密连接(tight junctions，TJs)复合体调控BBB细胞旁通透性^[7]。TJs由跨膜分子(claudins，occludin和JAMs)间的同型或异型相互作用形成，跨膜分子通过胞浆内zona occludin(ZO)受体分子结合于肌动蛋白细胞骨架^[8]。Claudin-5、occludin和ZO-1被认为是BBB正常和功能紊乱状态的敏感标识物^[9]。许多信号介质和药物通过调节TJ蛋白或TJ相关蛋白表达引起BBB功能障碍，尤其是claudin-5、occludin和/或ZO-1。研究表明claudins为细胞旁屏障形成所必需，缺失claudin-5的小鼠出现小分子物质选择性BBB渗漏；occludin对屏障的高阻抗维持十分重要；TJ相关胞浆蛋白ZO-1表达减少或从连接复合体分离与屏障通透性增高密切相关^[9]。血脑屏障功能障碍可导致离子失调、信号稳态改变，以及分子和免疫细胞进入中枢神经系统，引起神经系统功能紊乱和退行性变^[8]。

通常认为，稀土离子不能跨越完整且功能正常的BBB。放射性同位素示踪研究发现，静脉注射¹⁶⁹YbCl₃和¹⁵³SmCl₃后，稀土离子可进入脑组织，并以海马区浓度最高^[10-11]，因渗透系数很低(0.005 0%~0.000 3%)，通过血脑屏障细胞间隙的扩散(细胞间连接)是其主要途径^[12]。然而，BBB易受多种环境或病理因素的影响，导致TJs受损，分子渗透性增加，如在大鼠脑出血损伤或细胞氧化应激状态下，钆(Gd)通过血脑屏障的量明显增加^[13]。发育中的脑组织更易受重金属等外源性化学物影响，因为胎儿期和幼儿早期，对于化学物进入中枢神经系统，BBB只提供部分保护^[14]。且生命早期神经毒性化学物的暴露，可对脑发育和成熟产生广泛的不良影响，自婴儿期到衰老的整个生命期均可表现出功能障碍或疾病^[15]。

研究表明生长发育期LaCl₃暴露可致仔鼠海马镧含量显著升高，学习记忆能力下降^[2]。本研究结果显示，出生至断乳后1个月LaCl₃饮水暴露可使仔鼠体重下降，影响仔鼠生长发育，但海马系数并未出现明显改变，这与以往研究结果一致^[3]。本研究结果还显示，生后早期LaCl₃暴露可下调仔鼠海马claudin-5和occludin蛋白水平，且减少Cldn5 mRNA表达。提示，生长发育期LaCl₃暴露可破坏仔鼠血脑屏障紧密连接，这可能促进镧的神经发育毒性；镧对仔鼠海马血脑屏障紧密连接蛋白的下调作用，很可能是认知障碍的早期事件。