喉癌是发生于上皮细胞的一种头颈部常见恶性肿瘤，在耳鼻咽喉科肿瘤中位列第3位，近年来发病率呈上升趋势^[1]。其中喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是喉癌最常见的病理类型，占>90%。迄今为止，LSCC的病因及发病机制尚不清楚，空气污染、吸烟饮酒、病毒感染、遗传变异等因素可能是LSCC发生的原因，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活是主要的病因之一^[2-3]。miRNA是一类高度保守的长度约为22 nt非编码RNA分子，被认为是一类新型的癌基因或者抑癌基因，并且miRNA芯片研究表明多种miRNA是LSCC预后及诊断的独立影响因子，在LSCC发生发展中起着癌基因或者抑癌基因作用^[4-6]。miR-155是一个典型的多功能基因，可通过与下游靶基因如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/叉形头转录因子(forkhead box 3a，Foxo3a)、ras同源物基因家族成员A(Ras homolog gene family member A，RhoA)的mRNA3非编码区结合，进而参与造血干细胞、免疫反应、炎症反应、肿瘤发生等生物学过程^[7-8]。研究表明miR-155在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、喉癌等多种肿瘤中高表达，并且在其中起着癌基因的作用^{[7, 9]}。但是对于miR-155在喉癌中的具体作用机制尚不清楚，因此本研究通过脂质体转染miR-155 inhibitor，探讨miR-155表达下调后对LSCC细胞Hep2增殖的影响及机制。结果报告如下。

LSCC细胞Hep2(中国科学院细胞库)；兔抗细胞周期蛋白A1(cell cycle protein A1，cyclinA1)、cyclinD1、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、Foxo3a及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体(美国Epitmics公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8) 试剂盒、annexin V/propidium iodide流式双染试剂盒、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；胎牛血清、改良杜氏伊格尔培养基(Dulbeccos modified Eagle medium, DMEM)培养基、胰蛋白酶(美国Gbico公司)；miR-155 inhibitor及阴性对照(miR-155 NC)(上海吉玛生物有限公司)；trizol试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、Lipofectamine 2000(大连宝生生物技术有限公司)。FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)；迷你双垂直电泳仪、迷你转印电泳仪、ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

无血清Opti-MEM^® I培养基稀释miR-155 NC、miR-155 inhibitor及Lipofectamine 2000，将两者混匀，室温孵育20~30 min；将miRNA/Lipofectamine 2000复合物加入6孔板培养；6 h以后换成含10%血清的DMEM培养基，并用realtime-PCR检测miR-155的表达。

采用realtime-PCR法，将1×10⁴个Hep2细胞接种于6孔板，转染48 h后，收集细胞；根据trizol试剂盒说明书提取总RNA，采用微量紫外分光光度计检测RNA纯度，通过一步法RT-PCR试剂盒逆转录RNA，进行realtime-PCR扩增，扩增结果利用2^-ΔΔCT法进行分析。miR-155上游引物：5′-TAATGCTAATCGTGATAGGG-3′，下游：5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′，GAPDH上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′，下游：5′-TGGACTCCACGACGTACT-3′；每组设3个平行孔。

采用CCK-8法，将5×10³个Hep2细胞接种于96孔板，分别转染12、24、36、48、60、72 h后，加入CCK-8，继续培养4 h后，于酶标仪570 nm处测吸光度(A)值，代表细胞活力。

采用annexin V/PI流式双染法，将1×10⁴个Hep2细胞接种于6孔板，转染48 h后，收集细胞，按顺序分别加入结合液，annexin V及碘化丙啶，于1 h内在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

采用流式细胞术，将1×10⁴个Hep2细胞接种于6孔板，转染48 h后，收集细胞，加入5 μL终浓度为10 mg/mL的Rnase，37 ℃孵育1 h，再加入碘化丙啶染液，室温下避光染色30 min，用流式细胞仪进行细胞周期检测。

采用Western blot法，将1×10⁴个Hep2细胞接种于6孔板，转染48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液裂解30 min，离心，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据试剂盒法测定蛋白浓度；蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，湿法转膜30~50 min；一抗溶液(兔抗cyclinA1、cyclinD1、PI3K、AKT、p-AKT、Foxo3a及GAPDH单克隆抗体)，稀释度为1:100) 孵育，4 ℃过夜；次日二抗溶液室温孵育1~2 h；在凝胶成像系统中曝光，用Quantity one软件分析各抗体条带灰度值。

数据用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

Realtime-PCR结果显示，miR-155 NC组与miR-155 inhibitor组Hep2细胞中miR-155表达量分别为(1.25±0.10)、(0.34±0.03)；与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞中miR-155表达量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。提示，Hep2细胞转染miR-155 inhibitor成功。

Hep2细胞转染miR-155 NC及miR-155 inhibitor 24 h后，与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞活力明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图 1

注：A：miR-155 NC组；B：miR-155 inhibitor组；与miR-155 NC组比较，a P＜0.01。 图 1 miR-155 inhibitor对Hep2细胞活力影响(CCK-8)

结果显示，miR-155 NC组Hep2细胞早期、晚期凋亡率分别为(3.49±0.38)%、(5.84±0.58)%，miR-155 inhibitor组Hep2细胞早期、晚期凋亡率分别为(12.43±1.20)%、(18.96±1.85)%；与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞早、晚期凋亡率均明显升高，差异均有统计学意义(均P＜0.01)。

图 2

注：A：miR-155 NC组；B：miR-155 inhibitor组。 图 2 miR-155 inhibitor对Hep2细胞凋亡影响

与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞G1期比例明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。提示，miR-155 inhibitor组Hep2细胞周期阻滞在G1期。

表 1

表 1 miR-155 inhibitor对Hep2细胞周期影响(x±s，n=3) 组别 G1期 S期 G2期 miR-155 NC组 47.36±4.88 26.63±2.66 26.01±2.53 miR-155 inhibitor组 65.58±6.56a 18.46±1.84a 15.96±1.60a  注：与miR-155 NC组比较，a P＜0.01。

表 1 miR-155 inhibitor对Hep2细胞周期影响(x±s，n=3)

miR-155 NC组Hep2细胞中cyclinA1与cyclinD1表达量分别为(0.47±0.05)、(0.88±0.10)，miR-155 inhibitor组Hep2细胞中cyclinA1与cyclinD1表达量分别为(0.18±0.02)、(0.17±0.02)；与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞中cyclinA1及cyclinD1表达量下调，差异均有统计学意义(均P＜0.01)。

图 3

注：A：miR-155 NC组；B：miR-155 inhibitor组。 图 3 miR-155 inhibitor对Hep2细胞周期蛋白表达影响

与miR-155 NC组比较，miR-155 inhibitor组Hep2细胞中PI3K、p-AKT表达量下调，Foxo3a表达量上调，差异均有统计学意义(均P＜0.01)。

图 4

注：A：miR-155 NC组；B：miR-155 inhibitor组。 图 4 miR-155 inhibitor对Hep2细胞中PI3K/AKT/Foxo3a信号通路影响

表 2

表 2 miR-155 inhibitor对Hep2细胞PI3K/AKT/Foxo3a信号通路相关蛋白表达影响(x±s，n=3) 组别 PI3K p-AKT Foxo3a miR-155 NC组 1.34±0.13 1.22±0.12 0.14±0.01 miR-155 inhibitor组 0.35±0.03a 0.17±0.01a 0.35±0.03a  注：与miR-155 NC组比较，a P＜0.01。

表 2 miR-155 inhibitor对Hep2细胞PI3K/AKT/Foxo3a信号通路相关蛋白表达影响(x±s，n=3)

miRNA是一类真核生物中高度保守的非编码RNA分子，通过与靶基因的3'-非翻译区特异性结合，降解靶基因或者抑制靶基因转录，从而调控细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭等生物学行为^[4-6]。自1993年Lee等在线虫中发现了第1个miRNA(lin-4) 后，2002年Groce也首次报道了miRNA与肿瘤的关系，即在慢性淋巴细胞白血病中miR-15及miR-16表达下调或缺失。后续miRNA与肿瘤的关系引起了广泛兴趣。研究显示头颈部肿瘤组织拥有自己独特的miRNA表达特征及其靶基因，可通过这些miRNA及其靶基因的调控，进而为肿瘤诊断、治疗及预后提供理论依据^[10-11]。其中miR-155是一种常见的在多种肿瘤组织中被认为癌基因的miRNA，位于人染色体21q21，是由癌基因-B细胞整合簇(BIC)基因编码产生的，能通过介导Foxo3a、RhoA等多种靶基因表达参与造血干细胞、骨髓干细胞、炎症反应、免疫反应及肿瘤的发生发展过程^[7-9]。miR-155在包括LSCC在内的多种肿瘤组织中高表达，如Wang等^[12]利用RT-PCR法检测280例LSCC患者及560名年龄、性别相匹配的健康对照，结果表明LSCC组织中miR-155远高于健康对照，曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.933，敏感度为82.6%，特异性为89.2%，而且LSCC患者血浆中miR-155表达量也显著高于健康对照，AUC为0.757，敏感度为58.4%，特异性为69.5%。研究还表明miR-155 inhibitor能明显抑制Hep2细胞增殖与迁移，并诱导细胞凋亡^[13]。

本研究利用脂质体转染miR-155 inhibitor及miR-155 NC，并采用realtim PCR检测转染效果，结果表明miR-155 inhibitor可明显下调Hep2细胞中miR-155表达，表明miR-155 inhibitor转染成功。本研究结果显示，在转染24、36、48、60、72 h后，miR-155 inhibitor组Hep2细胞活力降低，细胞凋亡率明显增加，与王洋等^[13]研究结果一致。提示，miR-155 inhibitor对Hep2细胞活力具有抑制作用，对于细胞的凋亡具有诱导作用。肿瘤细胞的无限增殖来源于细胞周期的不可控制，通过调控细胞周期可一定程度的遏制肿瘤细胞的无限生长。而且细胞周期调控点是常见的抗肿瘤药物靶点，如G1期、G2期等^[14-15]。CyclinA1、cyclinD1是与G1期密切相关的细胞周期蛋白，其表达量上调，能加速G1进入S期，进而促进细胞的复制与分裂。本研究结果表明miR-155 inhibitor转染可使Hep2细胞周期阻滞在G1期，并下调cyclinA1、cyclinD1表达，进而遏制Hep2细胞的增殖。

细胞的增殖与凋亡受到多种信号通路调控，PI3K/AKT信号通路则是其中一种，在众多信号通路中发挥着重要作用，参与细胞增殖、凋亡、细胞周期、能量代谢、基因转录等生物学过程^[16-17]。在恶性肿瘤组织中PI3K/AKT信号通路被异常激活，反过来促进恶性肿瘤的发展，因而抑制PI3K/AKT信号通路能够促使肿瘤细胞的生长增殖受到抑制并发生程序性死亡^[16-17]。当PI3K受外部信号刺激后，将信号传递给AKT，磷酸化的AKT转入细胞核，下调下游多种细胞因子表达，Foxo3a则是其中一种。Foxo3a是叉头转录因子家族的一员，具有鲜明的叉头DNA结合域，能被AKT、血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoid-inducible kinase SGK)等蛋白激酶激活，后转入细胞质中，进而失去对细胞凋亡调控的能力。同时Foxo3a亦是miR-55的下游靶基因之一，miR-155对PI3K/AKT信号通路同样具有调控作用^[18-20]。本研究结果表明miR-155 inhibitor转染可明显下调PI3K、p-AKT表达，上调Foxo3a蛋白表达。提示，miR-155 inhibitor转染对Hep2细胞增殖具有抑制作用、对细胞凋亡具有促进作用，其机制可能与miR-155表达下调抑制PI3K/AKT信号通路、上调Foxo3a表达有关。