中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (7): 1066-1069   PDF    
引用本文
伏琼, 唐文娟, 程勇, 沈祥春, 梁冰. 漆姑草醇提物对HL-60细胞诱导分化作用[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(7): 1066-1069.
FU Qiong, TANG Wen-juan, CHENG Yong, et al. Differentiation of HL-60 cells inducted by Herba Saginae Japonicae ethanol extract[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(7): 1066-1069.
漆姑草醇提物对HL-60细胞诱导分化作用
伏琼1, 唐文娟1, 程勇1, 沈祥春1,2, 梁冰1,2    
1. 贵州医科大学药理学教研室, 贵州 贵阳 550025;
2. 环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室
收稿日期: 2017-02-10; 数字出版日期: 2017-5-25.
基金项目: 贵州省教育厅自然科学研究项目（黔教科2010033号）；贵州省科技创新人才团队项目[黔科合平台人才（2016）5625号]
作者简介: 伏琼(1993-), 女, 四川广元人, 硕士在读, 研究方向:新药筛选。
通讯作者: 梁冰, E-mail:bliang163@163.com
摘要：目的 探讨漆姑草醇提物（HSJ）对人早幼粒白血病细胞（HL-60）的诱导分化作用。方法 实验设漆姑草250.0、125.0、62.5 μg/mL组、阳性对照组（吡柔比星100 μg/mL）、对照组；噻唑蓝（MTT）法检测HL-60细胞增殖抑制率；瑞氏-吉姆萨染色法观察细胞形态；硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验法测定细胞分化能力；流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14阳性细胞的表达；Western blot法检测c-myc蛋白表达。结果 与对照组比较，漆姑草组HL-60细胞核浆比例减小，核仁变为肾形或蚕豆形，出现明显的细胞分化形态，细胞增殖受到不同程度抑制；对照组HL-60细胞NBT还原率为（0.83±0.29）%，CD11b和CD14阳性细胞表达率分别为（41.13±0.42）%、（53.30±7.23）%，c-myc蛋白表达量为（0.71±0.02）；漆姑草250.0、125.0、62.5 μg/mL组HL-60细胞NBT还原率[分别为（16.67±1.76）%、（10.83±1.26）%、（6.00±0.87）%]升高，CD11b和CD14阳性细胞表达率[分别为（66.77±4.27）%、（52.27±0.95）%、（46.27±0.38）%和（96.63±0.23）%、（85.25±3.80）%、（63.84±0.78）%]增加，c-myc蛋白表达量[分别为（0.38±0.01）、（0.45±0.01）、（0.58±0.02）]降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。结论 漆姑草醇提物可诱导HL-60细胞向成熟粒细胞、单核细胞方向分化。
关键词：漆姑草     HL-60细胞     诱导分化    
Differentiation of HL-60 cells inducted by Herba Saginae Japonicae ethanol extract
FU Qiong, TANG Wen-juan, CHENG Yong, et al     
Department of Pharmacology, Guizhou Medical University, Gui-yang, Guizou Province 550025, China
Abstract: Objective To study the effect of Herba Saginae Japonicae ethanol extract (HSJ) on the differentiation of human promyelocytic leukemia (HL-60) cells. Methods After 24 hours' incubation during logarithmic growth phase, the HL-60 cells were assigned into three experimental groups (treated with 250, 125, 62.5μg/mL HSJ), a positive control group (with 100 μg/mL pirarubicin), and a negative control group.The proliferation of HL-60 cells was detected with methyl thiazolyl tetrazolium bromide (MTT) assay; the cell morphology was observed with Wright-Giemsa staining; the cell differentiation ability was determined with nitroblue tetrazolium (NBT) reduction assay; the expressions of differentiation related antigen (CD11b and CD14) were measured with flow cytometry (FCM); and the expression of c-myc protein was detected with Western blot. Results Compared with the control group, the HSJ-treated HL-60 cells demonstrated apparent differentiation and inhibited proliferation, with decreased nucleus and cytoplasm ratios and kidney-or broad bean-shaped nucleoli.For the HSJ cells treated with 250, 125, and 62.5 μg/mL HSJ, the NBT reduction rates were 16.67±1.76%, 10.83±1.26%, and 6.00±0.87%;the CD11b positive rates were 66.77±4.27%, 52.27±0.95%, and 46.27±0.38%; and the CD14 positive rates were 96.63±0.23%, 85.25±3.80%, and 63.84±0.78%, respectively; all the indicators were significantly increased compared to those of negative control HSJ cells (0.83±0.29%, 41.13±0.42%, and 53.30±7.23%)(P < 0.05 for all).Wheaeas, the c-myc protein expressions (0.38±0.01, 0.45±0.01, and 0.58±0.02) of the HL-60 cells treated with different dosages of HSJ decreased significantly compared to that (0.71±0.02) of the negative control HSJ cells (P < 0.05). Conclusion HSJ can induce HL-60 cells differentiating into mature granulocytes or monocytes.
Key words: Herba Saginae Japonicae     HL-60 cell     induced differentiation    

白血病是常见的血液系统恶性肿瘤，其发生与造血干细胞增殖失控、分化成熟受阻以及正常凋亡程序失调有关，联合化疗仍是白血病治疗的主要手段[1]。全反式维甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)及三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)在急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)中的应用为白血病诱导分化治疗奠定了良好开端[2-3]。诱导白血病细胞分化已成为白血病治疗的主要策略之一。但就目前临床常用分化诱导剂来说，大多存在毒副作用多等缺点[4]，因此从传统中草药中开发高效低毒的分化诱导剂成为近年探索白血病治疗的目标之一。漆姑草为石竹科植物漆姑草的全草，为白血病治疗民间用药[5]。本研究拟观察漆姑草醇提物对人早幼粒白血病细胞(HL-60) 的诱导分化作用，为漆姑草制剂在治疗白血病临床应用提供理论依据。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

TS-100-F倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；Elx 800UV酶联免疫检测仪(美国Bio-tek公司)；BD FAC-SCantoTM Ⅱ Flow Cytometer 338960流式细胞仪(美国Becton Dikson公司)；凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)。漆姑草全草(贵阳市药材市场，经贵州医科大学龙庆德教授鉴定)，注射用盐酸吡柔比星(浙江海正辉瑞制药有限公司)；台盼蓝、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium bromide，MTT)、1640培养基及双抗(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Merck公司)；硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)(美国Sigma-Aldrich公司)；佛波酯(浙江联科生物有限公司)；瑞氏、吉姆萨粉剂(北京索莱宝科技有限公司)；异硫氰酸荧光素标记的单核、巨噬细胞单克隆抗体(fluorescein isothiocyanate-CD14，FITC-CD14)及别藻蓝蛋白标记的粒细胞单克隆抗体(allophycocyanin-CD11b，APC-CD11b)(美国BD公司)；c-myc、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)兔抗人单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；羊抗兔IgG-HRP(immunoglobulin-G horseradish peroxidase)(美国Santa Cruz公司)。

1.2 漆姑草醇提物制备

称取漆姑草全草50 g，加70%乙醇，50 ℃水浴提取4 h，趁热过滤，减压浓缩，得漆姑草醇提物干浸膏，精密称取适量制备20 mg/mL母液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，-20 ℃贮存备用。

1.3 分组与处理

HL-60细胞(中国科学院上海细胞库)培养于含有10%胎牛血清的1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。将对数生长期HL-60细胞制成1×105个/mL细胞悬液，均匀接种于96孔板中，培养24 h后，高、中、低漆姑草组分别加入终浓度为250.0、125.0、62.5 μg/mL漆姑草醇提物；阳性对照组加入终浓度为100 μg/mL的吡柔比星；对照组加入等体积培养基，每组设3个复孔，细胞继续培养48 h。

1.4 指标与方法 1.4.1 细胞增殖抑制率检测

采用MTT法，收集细胞，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，培养箱孵育4 h后，3 000 r/min离心15 min，弃上清。每孔加入200 μL DMSO，振荡溶解结晶，酶标仪测定波长为490 nm处的吸光度(A)值。取平均值计算细胞生长的抑制率。

1.4.2 NBT还原实验

收集细胞，离心弃上清, 沉淀加1 mg/mL NBT 200 μL和100 μg/mL的佛波酯10 μL混匀, 37 ℃避光温育1 h, 离心弃上清, 每个样本分别涂片3次, 光学显微镜下随机计数200个细胞, 计数阳性细胞数(胞质内含有灰蓝颗粒为阳性细胞), 取平均值计算NBT还原率。

1.4.3 细胞形态观察

采用瑞氏-吉姆萨染色法，收集细胞悬液，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤1次, 离心弃上清，沉淀加100 μL PBS重悬后涂片，甲醇固定10 min，双蒸水冲洗3 min, 晾干，加瑞氏-吉姆萨染色工作液(瑞氏-吉姆萨染色原液：PBS=1:9) 染色30 min，自来水冲洗3 min, 晾干，倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.4.4 分化相关抗原CD11b、CD14阳性细胞表达检测

采用流式细胞术，收集细胞，用预冷PBS洗2次，加入FITC-CD14单克隆抗体5 μL、APC-CD11b单克隆抗体3 μL，混匀，室温避光孵育15 min，用PBS洗1次，加PBS至流式管刻度线处，吹打均匀，流式细胞仪检测CD11b和CD14的荧光强度，分析CD11b、CD14阳性细胞表达率。

1.4.5 HL-60细胞c-myc蛋白表达检测

采用Western blot法，收集细胞，用预冷PBS洗1次，加裂解液(细胞裂解液:蛋白酶抑制剂=99:1), 冰上裂解15 min, 4 ℃, 12 000 r/min离心10 min, 吸取上清液，二喹啉甲酸法蛋白定量后制样，煮沸5 min。以10%的聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳分离，湿电转移法转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，室温下封闭1.5 h后加入加适当浓度的一抗(c-myc抗体1:1 000，GAPDH单抗1:5 000为内参照)，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次每次5 min，加二抗稀释液，室温孵育2 h，洗膜；化学发光法显色，暗室曝光，显影，定影，灰度值统计分析。

1.5 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 漆姑草对HL-60细胞增殖影响

250.0、125.0、62.5 μg/mL漆姑草组HL-60细胞增殖抑制率分别为61.63%、44.39%、28.63%；经不同浓度漆姑草作用后，HL-60细胞增殖能力受到不同程度抑制，IC50为156 μg/mL。

2.2 漆姑草对HL-60细胞NBT还原能力影响

不同浓度漆姑草作用细胞后，NBT还原反应中沉积有蓝黑色颗粒的HL-60细胞数目明显增加；对照组、250.0、125.0、62.5 μg/mL漆姑草组HL-60细胞NBT还原率分别为(0.83±0.29)%、(16.67±1.76)%、(10.83±1.26)%、(6.00±0.87)%；与对照组比较，漆姑草组HL-60细胞NBT还原率升高，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

2.3 漆姑草对HL-60细胞形态影响(图 1)

对照组HL-60细胞胞核呈圆形，结构完整，核浆比例较大(图 1A)；经不同浓度HSJ处理后，细胞核浆比例减小，出现分叶状细胞核，部分细胞核凹陷呈肾形、蚕豆形，出现明显的细胞分化状态，随着漆姑草浓度增加细胞核呈肾形的细胞增多(图 1B、C、D)。

注：A：对照组；B、C、D：漆姑草250.0、125.0、62.5 μg/mL组。 图 1 漆姑草对HL-60细胞形态影响(瑞氏-吉姆萨染色，×400)

2.4 漆姑草对HL-60细胞分化相关抗原CD11b、CD14阳性表达影响(表 1)

与对照组比较，各剂量漆姑草组HL-60细胞分化相关抗原CD11b、CD14阳性细胞表达率均不同程度提高，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

表 1 漆姑草对HL-60细胞CD11b、CD14阳性表达影响(x±s，n=3，%)

2.5 漆姑草对HL-60细胞c-myc蛋白表达影响(图 2)

对照组、250.0、125.0、62.5 μg/mL漆姑草组HL-60细胞c-myc蛋白表达量分别为(0.71±0.02)、(0.38±0.01)、(0.45±0.01)、(0.58±0.02)；与对照组比较，各剂量漆姑草组HL-60细胞中c-myc蛋白表达降低，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。

注：1：对照组；2~4：62.5、125.0、250.0 μg/mL漆姑草组。 图 2 漆姑草对HL-60细胞c-myc蛋白表达影响

3 讨论

APL是造血系统恶性克隆性疾病[6]，其特点是异常早幼粒细胞无限增殖并伴有分化受阻，因此促进细胞分化是其治疗的主要策略。HL-60细胞是急性早幼粒白血病细胞，具有巨大的分化潜力，当其向正常成熟方向分化时，细胞的形态、功能、分化相关抗原和蛋白表达均会发生一系列变化。细胞的分化成熟度与细胞增殖能力呈负相关，即细胞分化越成熟，其生长能力越弱，因此药物对肿瘤细胞的增殖抑制能力，是其分化的一个重要标志。NBT是一种水溶性淡黄色活性染料，可让分化细胞，在佛波酯的激发下，细胞内超氧阴离子产生增多可将NBT还原为不溶性蓝黑色颗粒-甲臜。细胞分化成熟度越高、细胞功能越完善，则细胞NBT还原能力越强[7]。

本研究结果显示，不同浓度漆姑草提取物对HL-60细胞增殖能力具有抑制作用，并呈剂量依赖关系；与对照组比较，漆姑草组HL-60细胞NBT阳性率明显增加。提示，HL-60细胞在漆姑草作用下细胞具有一定的分化潜能。本研究结果还显示，漆姑草组HL-60细胞核质比例小，细胞核出现肾形、蚕豆形等分化形态。提示，细胞向成熟阶段分化。细胞表面抗原检测，可进一步了解细胞所处的分化阶段和方向，CD11b是成熟粒系细胞分化的标志[8]，而CD14是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的分化抗原[9]。c-myc基因是一个与细胞增殖、分化等相关的基因，有研究发现，其在HL-60细胞中异常高表达可抑制细胞向成熟方向分化，而在分化发生时c-myc表达下降[10]。本研究结果显示，与对照组比较，漆姑草组HL-60细胞CD14和CD11b阳性表达增加，细胞c-myc蛋白表达明显降低，且呈剂量效应关系。提示，漆姑草可诱导HL-60细胞逐渐向成熟粒细胞、单核细胞方向分化，其机制可能与漆姑草抑制HL-60细胞c-myc蛋白表达有关。

参考文献
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