2017, Vol. 33
2. 延边大学医学院
氧化应激是指细胞暴露于高浓度氧分子或氧的化学衍生物而引起的细胞损伤[1]。在肝损伤发生发展过程中，氧化应激为其重要损伤机制和环节[2]。因此，寻找对抗肝细胞氧化应激的药物可为防治肝损伤提供有效途径。近年来，越来越多的研究证实中草药抗氧化成分具有多靶点、毒性小等优点[2]。草苁蓉(Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov)为列当科草苁蓉属多年生寄生性草本植物，具有补肾壮阳、润肠止血、滋补强身、延年益寿功效；用于治疗腰膝冷痛、肾虚阳痿、肾炎以及膀胱出血等疾病[3]。研究表明，草苁蓉具有抗氧化、抗炎、提高免疫力及抗肿瘤等作用[3-5]。草苁蓉多糖是从草苁蓉中提取出来的活性成分，其含量在全株平均可达30%[4-6]。本研究选取可传代的人正常肝实质细胞-张氏肝(Chang liver)细胞为研究对象，建立过氧化氢(H2O2)诱导的细胞氧化应激损伤模型，观察草苁蓉多糖对肝细胞氧化损伤的保护作用，结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器张氏肝细胞(延边大学药学院南极星教授惠赠)；胎牛血清及Dulbecco's minimum essential medium(DMEM)高糖培养基(美国Gibco公司)；噻唑蓝(美国Sigma公司)；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdelyde, MDA)试剂盒(南京建成科技有限公司)。3-30K型离心机(美国Sigma公司)；S22PC型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；RT-2100型酶标仪(深圳雷杜公司)。
1.2 草苁蓉多糖制备草苁蓉采自吉林省长白山，经延边大学药学院刘勇镇教授鉴定为草苁蓉；草苁蓉多糖采用常规醇沉法提取，用Sevag法分离除去多糖中的蛋白质；酸水解后用薄层层析鉴定，结合氕核磁共振确定多糖成分，草苁蓉多糖得率为4.4%，含量为67.3%[5]。
1.3 细胞培养张氏肝细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、含5%CO2、饱和湿度条件下常规培养[2, 7-8]；细胞呈单层贴壁生长，取对数生长期细胞进行试验。
1.4 指标与方法 1.4.1 细胞存活率检测对数生长期细胞以5×104个/mL接种于96孔板，培养12 h后用于试验；实验设草苁蓉多糖0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L组，每组做6个复孔；继续培养24 h，取出培养板，用噻唑蓝法测定细胞存活率[7]，以细胞存活率≥90%为标准确定草苁蓉多糖对细胞的安全浓度[2]。实验重复3次。另取一批细胞以5×104个/mL接种于96孔板中，孵育12 h后用于试验；实验设对照组、模型组及草苁蓉低、中、高剂量组；对照组加入培养液，模型组加入H2O2(终浓度为300 μmol/L)，草苁蓉低、中、高剂量组分别加草苁蓉多糖25、50、100 mg/L，24 h后再加入H2O2(终浓度为300 μmol/L)；继续培养12 h，噻唑蓝法测定细胞存活率。每组做6个复孔，实验重复3次。
1.4.2 细胞外液中LDH、ALT、AST释放率检测[7]细胞按1.4.1方法分组与处理，收集培养液上清，按试剂盒说明书步骤测定细胞外液中LDH、ALT、AST活性。
1.4.3 细胞中MDA、GSH、SOD检测细胞按1.4.1方法分组与处理，细胞用胰酶消化，收集并破碎细胞，离心取上清，按试剂盒说明书步骤测定细胞内SOD、GSH、MDA水平[7]。
1.5 统计分析数据以x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析和Turkey's多因素t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 草苁蓉多糖对肝细胞增殖影响草苁蓉多糖浓度为200 mg/L时，细胞存活率为85%，具有细胞毒性；而浓度在12.5~100 mg/L范围时，细胞存活率均大于94%，表明，在此浓度范围内，草苁蓉多糖对张氏肝细胞无细胞毒作用，对细胞安全。
2.2 草苁蓉多糖对肝细胞存活率影响模型组肝细胞存活率为(52.5±1.2)%，明显低于对照组(100%)，差异有统计学意义(P < 0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量草苁蓉组肝细胞存活率明显升高，差异有统计学意义(P < 0.05)，且呈剂量效应关系(P < 0.05)。
2.3 草苁蓉多糖对肝细胞外液中LDH、ALT、AST释放影响(表 1)
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表 1 草苁蓉对细胞外液LDH、ALT、AST释放影响(U/L，x±s, n=6) |
与对照组比较，模型组细胞培养液中LDH、ALT、AST活性显著升高(P < 0.05)；与模型组比较，草苁蓉各剂量组细胞培养液中LDH、ALT、AST活性显著降低(P < 0.05)。
2.4 草苁蓉对肝细胞内MDA、GSH、SOD水平影响(表 2)|
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表 2 草苁蓉对肝细胞中MDA、GSH、SOD水平影响(x±s，n=6) |
与对照组比较，模型组肝细胞内MDA含量明显升高(P < 0.05)，GSH和SOD水平均明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，草苁蓉各剂量组肝细胞内MDA含量明显降低(P < 0.05)，GSH和SOD水平升高(P < 0.05)。
3 讨论本研究结果显示，浓度小于100 mg/L时，草苁蓉多糖对张氏肝细胞无毒性，也无促进生长作用；但对过氧化氢损伤肝细胞可提高其存活率。提示，草苁蓉多糖对过氧化氢诱导的肝细胞损伤具有保护作用。H2O2诱导的肝细胞氧化损伤中氧化应激是其重要损伤机制。氧化应激水平的提高能够损伤细胞甚至导致细胞死亡[9]。细胞受到损伤后，细胞内生成大量活性自由基，损耗细胞内源性抗氧化剂如GSH等，并生成脂质过氧化终产物MDA；同时，损伤的细胞膜通透性增强，胞内酶如ALT、AST、LDH等大量外释；最终导致细胞死亡[9]。因此，当肝细胞受到氧化应激损伤时，转氨酶和LDH释放，其释放量可准确描述细胞受损程度[9]。本研究结果显示，H2O2可使肝细胞外液中转氨酶和LDH活力升高，致细胞损伤，而草苁蓉多糖可使细胞外液中转氨酶和LDH活力降低，提示草苁蓉多糖具有拮抗H2O2致肝细胞损伤能力。
机体的抗氧化系统分为抗氧化酶系统和非酶系统[2]，而MDA作为细胞膜脂质过氧化的终产物，其水平可间接表示细胞自由基水平[2]。本研究结果显示，H2O2使肝细胞内MDA含量升高，SOD和GSH水平降低；而草苁蓉多糖可降低H2O2损伤的肝细胞内MDA含量、升高细胞内SOD和GSH水平。提示，草苁蓉多糖对H2O2所致肝细胞损伤具有一定程度保护作用，其机制与草苁蓉多糖可提高肝细胞抗氧化能力有关。
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