中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (6): 926-929   PDF    
引用本文
左魁阳, 陈梦茜, 韩瑞杰, 王小花, 孟娜娜, 金秀东, 刘海峰. TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(6): 926-929.
ZUO Kui-yang, CHEN Meng-xi, HAN Rui-jie, et al. Construction and identification of yeast two-hybrid expression vector containing human transforming growth factor-beta 1 and different fragments of transforming growth factor-beta receptor type Ⅱ[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(6): 926-929.
TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建
左魁阳1, 陈梦茜2, 韩瑞杰1, 王小花2, 孟娜娜1, 金秀东1, 刘海峰1    
1. 牡丹江医学院医药研究中心, 黑龙江 牡丹江 157011;
2. 牡丹江医学院基础医学院
收稿日期: 2016-12-01; 数字出版日期: 2017-5-5 13:05.
基金项目: 国家自然科学基金（81500471）；黑龙江省自然科学基金（H2015080）；黑龙江省卫生厅项目（2014-212；2016-355）；研究生创新科研基金（2014YJSCX-07）
作者简介：左魁阳(1988-), 男, 黑龙江牡丹江人, 硕士在读, 研究方向: 抗纤维化。
通讯作者：刘海峰, E-mail: fenghailiu510@163.com金秀东, E-mail: mdjmujin@163.com; 刘海峰, E-mail: fenghailiu510@163.com金秀东, E-mail: mdjmujin@163.com
摘要：目的 克隆人转化生长因子β1（TGF-β1）和4个受体基因片段，构建酵母表达载体，为应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持。方法 提取人血液中RNA，逆转录转为cDNA，PCR扩增TGF-β1和4个受体（TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D）基因片段，双酶切后，分别插入酵母双杂交表达载体pGBKT7和pGADT7；经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后，构建质粒pGBKT7-TGF-β1和pGADT7-TβRⅡ-A、pGADT7-TβRⅡ-B、pGADT7-TβRⅡ-C和pGADT7-TβRⅡ-D。结果 成功扩增TGF-β1基因（1 200 bp）和TβRⅡ-A（453 bp）、TβRⅡ-B（366 bp）、TβRⅡ-C（276 bp）和TβRⅡ-D（165 bp）基因片段，经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确。结论 成功构建pGBKT7-TGF-β1和pGADT7-TβRⅡ-A、pGADT7-TβRⅡ-B、pGADT7-TβRⅡ-C和pGADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体。
关键词：人转化生长因子β1（TGF-β1）     TGFβⅡ型受体     质粒构建     酵母双杂交    
Construction and identification of yeast two-hybrid expression vector containing human transforming growth factor-beta 1 and different fragments of transforming growth factor-beta receptor type Ⅱ
ZUO Kui-yang, CHEN Meng-xi, HAN Rui-jie, et al     
Medical Research Center, Mudanjiang Medical College, Mudanjiang, Heilongjiang Province 157011, China
Abstract: Objective To clone human transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) and 4 genome fragments of its receptor and to construct the yeast expression vector to provide technical support for using yeast two-hybrid in identification of interaction domain of TGF-β type Ⅱ receptor (TβRⅡ) with TGF-β1. Methods The gene TGF-β1 and gene fragments of TβRⅡ from the RNA of human peripheral blood were amplified with regular PCR using specific primers, and then cloned into yeast two-hybrid expression vector pGBKT7 and pGADT7.The recombinant plasmids pGBKT7-TGF-β1 and pGADT7-TβRⅡ-A, pGADT7-TβRⅡ-B, pGADT7-TβRⅡ-C, pGADT7-TβRⅡ-D sequences were confirmed with PCR, restriction endonucleases digestion, and automated DNA sequencing. Results The yeast two-hybrid expression vector pGBKT7-TGF-β1 (1 200 bp) and pGADT7-TβRⅡ-A (453 bp), pGADT7-TβRⅡ-B (366 bp), pGADT7-TβRⅡ-C (276 bp), pGADT7-TβRⅡ-D (165 bp) were successfully constructed and the sequences of the plasmids' DNA were correct. Conclusion The yeast two-hybrid expression vectors pGBKTT-TGFβ1 and pGADT7-TβRⅡA, B, C, and D were successfully constructed.
Key words: transforming growth factor-beta 1     transforming growth factor-beta receptor type Ⅱ     plasmid construction     yeast two-hybrid    

组织器官(肝脏、肾脏、心肌组织等)纤维化引起的器官功能衰竭，已成为危害人类健康的重要原因之一，而人转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1) 在纤维化发生发展中起重要作用[1]。在哺乳动物中，已经克隆出3种TGF-β，分别为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。虽然它们在体外显示类似的功能，但在纤维化的发生发展中，多由于TGF-β1的过量表达引起细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)和胶原蛋白的过度产生、沉积而引起纤维化，因此TGF-β1被认为是器官纤维化的一个关键环节。TGF-β1的生物学功能是通过与其细胞膜上的受体相结合来实现的，其受体包括转化生长因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受体(TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ)。TGF-β1首先与TβRⅡ结合，使其二聚化，二聚化的TβRⅡ可使TβRⅠ转磷酸化，引起TGF-β/Smads和非TGF-β/Smads信号转导[2]而调控基因转录。因此，TβRⅡ对于TGF-β1的生物活性是必须的[3-4]。酵母双杂交技术广泛用于检测蛋白质-蛋白相互作用[5-7]，用于酵母双杂交系统检测的蛋白质，分别与含有DNA结合结构域酵母双杂交诱饵载体(pGBKT7) 或转录因子的激活结构域酵母双杂交激活载体(pGADT7) 结合，这2种蛋白质的相互作用带来AD(activating domain)和BD(binding domain)结构域共同激活下游的转录基因。本研究从人血液提取RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增TGF-β1基因和4个截短型TβRⅡ(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)，将其分别插入到pGBKT7和pGADT7中，旨在为下一步应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ的区域提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

酵母双杂交载体pGADT7、pGBKT7、大肠杆菌感受态细胞(DH5α)(牡丹江医学院医药研究中心)；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技北京有限公司)；TRizol® LS Reagent(上海拜力生物科技有限公司)；2×Es Taq MasterMix(Dye)(北京康为世纪公司)；10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo、2 mM dNTPs、25 mM MgSO4、KOD-Plus-Neo(日本东洋纺公司)；Nde I、Bam HI、EcoR I、T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接Buffer(宝生物工程大连有限公司)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(罗氏诊断产品上海有限公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 RNA提取和逆转录

人新鲜血液RNA抽提，每0.25 mL血液样品中加入0.75 mL Trizol® LS，混匀；参照TRizol® LS试剂说明书进行样品分离、RNA沉淀、RNA洗涤和悬浮。用紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度。RNA样本用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录：RNA 1 μg、anchored-oligo[dT]18 Primer 1 μL、random hexamer primer 2 μL、用水补至13 μL，混匀，65 ℃、10 min，冰上2 min，向混合液中加入5×transcriptor RT reaction buffer 4 μL，protector RNase inhibitor 0.5 μL，deoxynucleotide mix 2 μL，transcriptor reverse transcriptase 0.5 μL；逆转录条件为：25 ℃、10 min，50 ℃、1 h，85 ℃、5 min，4 ℃、1 h。

1.3 TGF-β1基因和4种受体基因片段扩增

利用引物设计软件设计引物(表 1)，以RT产物cDNA为模板，分别以F11 & R22、F1 & R1、F2 & R1、F3 & R1、F4 & R1为引物，PCR扩增TGF-β1基因和TβRⅡ-A, TβRⅡ-B, TβRⅡ-C和TβRⅡ-D基因片段。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，每个循环95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min 30 s/50 s，共35个循环，最后72 ℃总延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖电泳后，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书做胶回收。

表 1 引物序列

1.4 酵母双杂交载体构建

经限制性内切酶Nde I和EcoR I酶切pGBKT7质粒和TGF-β1基因片段，以及限制性内切酶Bam HI和EcoR I酶切pGADT7质粒和TBRⅡ-A、TBRⅡ-B、TBRⅡ-C、TBRⅡ-D 4个基因片段，割胶回收，在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜，转化至氯化钙法制备的DH5α中，涂布到含有卡那霉素/氨苄霉素的平板培养基上，37 ℃烘箱过夜培养12 h，挑取单克隆菌落。

1.5 酵母双杂交载体鉴定

将挑取的单克隆菌落，在含卡那霉素/氨苄霉素LB(溶菌肉汤)液体培养基培养后，抽提质粒，进行PCR和双酶切鉴定，鉴定正确的阳性菌株送上海生工生物工程有限公司测序。新重组的质粒分别命名为：pGBKT7-TGF-β1和pGADT7-TβRⅡ-A、pGADT7-TβRⅡ-B、pGADT7-TβRⅡ-C、pGADT7-TβRⅡ-D。

2 结果 2.1 目的基因TGF-β1和受体扩增(图 1)
注：A1-2：TGF-β1；B1~4：TβRⅡ-A、B、C、D。 图 1 TGF-β1(A)和TβRⅡ受体(B) PCR扩增产物电泳图

以逆转录cDNA为模板和F11 & R22为引物，TGF-β1的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，产物条带大小约为1 200 bp左右，与预期一致(图 1A)。以逆转录cDNA为模板和F1 & R1、F2 & R2、F3 & R3、F4 & R4为引物，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C和TβRⅡ-D产物条带大小分别为453、366、276、165 bp左右，与预期一致(图 1B)。

2.2 酵母双杂交载体的PCR鉴定(图 2)
注：A1：TGF-β1质粒；B1~4：TβRⅡ-A、B、C、D质粒。 图 2 TGF-β1和TβRⅡ-A、B、C、D质粒PCR扩增产物电泳图

将挑取的克隆菌株DH5α/pGBKT7-TGF-β1加入到Luria-Bertani(LB)液体培养基内摇菌过夜，抽提质粒pGBKT7-TGF-β1为模板，以F11 & R22为引物进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在1 200 bp处有一明亮单一条带，与预期结果相符(图 2A)。试剂盒抽提DH5α/pGADT7-TβRⅡ-A、B、C、D菌株质粒，质粒为模板，以F1 & R1、F2 & R2、F3 & R3、F4 & R4为引物，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别在453、366、276、165 bp处有一明亮单一条带，与预期结果相符(图 2B)。

2.3 酵母双杂交载体的双酶切鉴定(图 3)
注：A1：TGF-β1质粒；B1~4：TβRⅡ-A、B、C、D质粒。 图 3 TGF-β1和TβRⅡ-A、B、C、D质粒酶切鉴定

抽提DH5α/pGBKT7-TGF-β1菌株质粒，经限制性内切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，pGBKT7载体7 300 bp左右和TGF-β1基因片段1 200 bp，分别与预期酶切条带相符(图 3A)。抽提DH5α/pGADT7-TβRⅡ-A、B、C、D菌株质粒，经限制性内切酶Bam HI和EcoR I双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，pGADT7载体8 000 bp左右和TβRⅡ-A基因片段453 bp、TβRⅡ-B基因片段366 bp、TβRⅡ-C基因片段276 bp、TβRⅡ-D基因片段165 bp目的条带，分别与预期酶切条带相符(图 3B)。

2.4 酵母双杂交载体的DNA测序(图 4)
注：A：TβRⅡ-A基因；B：TβRⅡ-B基因；C：TβRⅡ-C基因；D：TβRⅡ-D基因。 图 4 运用NCBI BLAST软件比对pGADT7载体上的TβRⅡ-A、B、C、D序列

将试剂盒抽提的pGADT7-TβRⅡ-A、B、C、D菌株质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，结果表明插入在pGADT7载体上的序列TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C和TβRⅡ-D与Genebank公布的序列相一致。

3 讨论

转化生长因子-β(TGF-β)在纤维化过程中发挥关键作用，被公认为是纤维化形成与发展的启动枢纽，TGF-β1的过量表达是诱发纤维化疾病的重要因素，而TGF-β1和TβRⅡ的相互作用在TGF-β1/Smad和TGF-β1/MAPK(mitogen-activated protein kinase)介导的信号通路中发挥着关键作用。因此，如能筛选到与TGF-β1相互作用较强的TβRⅡ，将与野生型TβRⅡ竞争结合过量表达的TGF-β1，弱化野生型TβRⅡ与TGF-β1的相互作用，可起到抗纤维化作用。本研究拟构建TGF-β1和4个截短型人转化生长因子β Ⅱ型受体(TβRⅡ-A、B、C、D)基因片段的酵母双杂交表达载体，构建好的4个截短型人转化生长因子β Ⅱ型受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C和TβRⅡ-D)分别对应的氨基酸数为151、122、92、55 aa。

在人血液中提取RNA过程中，置放6 h以上的血液所提取的RNA很容易降解，而用新鲜血液提取RNA降解概率则会减小。同时，RNA洗涤时，加入75%乙醇混匀，4 ℃、14 000 g离心5 min，弃掉上清液，干燥空气中放置5~10 min，需让乙醇全部挥发，以免影响RNA浓度。另外，为防止RNA降解，可以在Trizol® LS中加入异硫氰酸胍。异硫氰酸胍被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。因此，当样品为富含RNA酶的组织时，利用它可取得满意的效果[8]。

酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备蛋白质。而目前常用的酵母表达系统之一为巴斯德毕氏酵母，基因可得到高水平的表达[9]。由于TGF-β1基因片段为1 200 bp左右，目的基因片段相对较大，因此TGF-β1与pGADT7连接相对困难，解决的方法主要包括：适当增加基因片段和质粒的摩尔比；增加连接的时间；将目的基因与载体进行梯度连接；涂板后过夜观察固体培养基菌落情况，以增加阳性克隆的出现。本研究结果表明成功构建TGF-β1和4个不同的TβRⅡ基因片段的酵母表达载体，可为进一步运用酵母双杂交系统筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ的关键区域提供技术支持。

参考文献
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