2017, Vol. 33
2. 贵州医科大学附属医院;
3. 贵州省骨科医院;
4. 贵州省人民医院
氟中毒可影响学习记忆能力，这与氟离子可通过血脑屏障造成中枢神经系统损伤密切相关。研究表明给大鼠过量氟摄入其学习记忆能力下降、脑组织受损[1-2]。贵州省是中国燃煤型氟中毒重灾区，其防治研究一直备受人们关注。对于地方性氟中毒的防治祖国医学有独到之处，利用补肾壮骨、活血化淤及利尿排氟的机制，起到减轻机体氟含量作用。百合科植物天门冬具有养阴清热、润肺滋肾的功效，治阴虚、抗氧化[3]。本研究通过饲料中添加氟化钠方法构建氟中毒SD(Sprague-Dawley)大鼠模型，观察天门冬对氟中毒所致大鼠学习记忆障碍的改善作用，旨在为中医药在氟中毒治疗领域的应用提供依据。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器氟化钠，分析纯(无锡市展望化工试剂有限公司)；天门冬(贵阳仁济堂)，天门冬水煎剂的制备：用天平称取天门冬50 g，加10倍量水，称重回流提取2次，1 h /次，过滤再用水准确补足减少的重量，药液经过减压浓缩，得浓度为1 g /mL天门冬水提取液(主要成分为天门冬多糖和总皂苷)。PXJ-1B型数字式离子计(江苏江分店精密分析仪器有限公司)；pF-1型氟离子选择性电极(上海精密科学仪器有限公司)；T5000Y型电子天平(常熟双杰测试仪器厂)；Morris水迷宫图像自动采集和处理系统(中科院药物研究所)；YTS-3TB跳台机(北京众实迪创科技发展有限责任公司)。
1.2 实验动物60只清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重90~100 g，由贵州省动物实验中心提供，许可证号：SCXK(黔)2012-0001，饲养环境：室温22~25 ℃，湿度45% ~70%，动物中心提供饲料。
1.3 分组与处理大鼠1周适应性饲养后，随机分为对照组、染氟组、天门冬低、中、高剂量组(3、6、12 g/kg)，每组12只，雌雄各半。对照组给予基础饲料，染氟组与天门冬各剂量组大鼠饲料中添加氟化钠，含氟量为50 mg/kg，各剂量天门冬组大鼠灌胃给予天门冬水煎剂，1次/d，连续3个月，染氟组给予等量蒸馏水。
1.4 指标与方法 1.4.1 氟斑牙观察每天观察各组大鼠牙齿变化情况，判定大鼠牙齿的损伤程度并记录；处死大鼠前对各大鼠的牙齿进行拍照，氟斑牙分度参考国家标准进行[4]。
1.4.2 尿氟和骨氟含量检测在处死大鼠之前用代谢笼收集24 h尿样，使用氟离子选择电极法测定尿氟含量。在处死大鼠后，取长骨，将附着的筋肉和脂肪剔除干净，105 ℃烘箱内烘干；捣碎，在电炉上炭化至无烟，灰化呈白色粉末状；采用高温灰化-氟离子选择电极法检测骨氟含量。
1.4.3 Morris水迷宫实验采用Morris水迷宫图像自动采集和处理系统，实验分为定位航行及空间探索2部分；实验过程中保持安静及光线一致，定位航行试验时将大鼠从不同象限入水点面向池壁放入水中，观察大鼠自入水点找到平台所需时间(逃避潜伏期)和航行轨迹。大鼠在60 s内若未找到平台，人为将大鼠引到平台上并停留10 s，此时潜伏期计为60 s，电脑记录大鼠成绩，连续4 d。第5天进行空间探索实验(测试大鼠对原平台的记忆)，撤除平台，将各组大鼠从平台对侧象限放入水中，记录其在60 s内跨越平台的次数与在平台所在象限停留时间。
1.4.4 跳台实验将各组大鼠放入跳台箱内熟悉箱内环境3 min，随后立即通以100 V 3 mA交流电。当通电后大鼠受到电击的正常反应是跳回平台躲避电击，开始计时并观察5 min内大鼠首次受电击后跳上平台所需时间(反应时间)，大鼠5 min内跳下平台受电击的次数(即错误次数)作为学习成绩。24 h后测试其记忆能力：把已训练过的大鼠安静地置于跳台上，接通电源即开始记录时间，观察通电开始至大鼠走下平台时间(即潜伏期)，并记录在5 min内大鼠走下平台遭受电击的次数(即错误次数)，作为记忆成绩。
1.5 统计分析数据采用x±s表示，使用SPSS 22.0软件对数据进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据，用单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用最小显著差法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 染氟对大鼠氟斑牙发生率影响结果显示，对照组大鼠未出现氟斑牙；染氟组大鼠氟斑牙发生率为100%，主要为中、重度氟斑牙，占75.0%(9/12)；天门冬各剂量组大鼠氟斑牙发生率也为100%，但中、重度比例明显减少，其中低、中、高剂量天门冬组大鼠中、重度比例分别为33.3%(4/12)、33.3%(4/12)、16.7%(2/12)。
2.2 天门冬对氟中毒大鼠尿氟和骨氟含量影响(表 1)
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表 1 天门冬对氟中毒大鼠尿氟和骨氟含量影响(x±s，n=12) |
与对照组比较，染氟组大鼠尿氟与骨氟含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与染氟组比较，各剂量天门冬组大鼠尿氟含量明显升高，骨氟含量明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；呈剂量效应关系。
2.3 天门冬对氟中毒大鼠学习记忆能力影响 2.3.1 大鼠水迷宫实验(表 2)|
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表 2 天门冬对氟中毒大鼠学习记忆能力影响(水迷宫试验，x±s，n=12) |
定位航行试验结果显示，与对照组比较，染氟组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P＜0.05)；与染氟组比较，中、高剂量天门冬组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)。空间探索实验结果显示，与对照组比较，染氟组大鼠首次穿越平台时间明显延长、穿越次数减少、穿越平台区时间缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)；与染氟组比较，高剂量天门冬组大鼠首次穿越平台时间明显缩短、穿越次数增加、穿越平台区时间延长，差异有统计学意义(P＜0.05)；与低剂量天门冬组比较，高剂量天门冬组大鼠首次穿越平台时间缩短、穿越次数增加、穿越平台区时间延长，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.3.2 大鼠跳台实验(表 3)|
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表 3 天门冬对氟中毒大鼠学习记忆能力影响(跳台试验，x±s，n=12) |
学习成绩测试结果显示，与对照组比较，染氟组大鼠反应时间明显延长、错误次数明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与染氟组比较，中、高剂量天门冬组大鼠反应时间缩短，高剂量天门冬组大鼠错误次数减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。记忆成绩测试结果显示，与对照组比较，染氟组大鼠潜伏时间明显缩短、错误次数明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与染氟组比较，中、高剂量天门冬组大鼠潜伏时间明显延长、错误次数明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)；与低剂量天门冬组比较，高剂量天门冬组大鼠潜伏时间延长、错误次数减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论氟中毒是全球分布地方病，贵州省是中国特有的燃煤型氟中毒重灾区，氟中毒对机体损害主要表现在牙齿与骨骼[5-6]，并对软组织脏器、脑等均存在明显的毒性损伤[7]。氟中毒致脑损伤已引起研究者们广泛关注。氟可导致机体出现骨痹阳虚、血虚、血瘀、促氧化等症状，天门冬则具有养阴清热、润肺滋肾的功效，治阴虚、抗氧化，可达到活血补肾壮骨、促进尿氟排出作用[3]。本研究结果显示，染氟组大鼠氟斑牙程度、尿氟和骨氟含量均明显高于对照组；高剂量天门冬组大鼠氟斑牙程度、骨氟含量明显低于染氟组，尿氟含量则明显高于染氟组。提示，天门冬可通过促进肾对尿氟的排泄，降低机体氟含量，降低氟在骨骼中沉积，起到氟中毒的防治作用。
脑部是氟中毒损伤重要的软组织器官，学习记忆等认知功能是脑的高级神经活动，机体长期过多蓄积氟化物会引起中枢神经系统的损伤[8-9]。研究显示，学习记忆认知行为紊乱是氟中毒损伤脑组织的主要临床表现[10-11]。氟中毒致软组织损伤过程中，自由基、脂质过氧化是主要机制[12-13]。研究发现，贵州产中草药天门冬具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡等作用[14-16]。本研究结果显示，水迷宫定位航行实验中染氟组大鼠平均逃避潜伏期明显长于对照组，中、高剂量天门冬组大鼠逃避潜伏期明显短于染氟组；空间探索实验中染氟组大鼠首次穿越平台时间明显长于对照组、穿越平台次数和平台区时间明显低于对照组，高剂量天门冬组大鼠首次穿越平台时间短于染氟组，穿越平台次数、穿越平台区时间多于染氟组；学习能力测试结果显示，染氟组大鼠反应时间明显长于对照组、错误次数多于对照组，高剂量天门冬组大鼠反应时间短于染氟组、错误次数少于染氟组；记忆测试结果显示，染氟组大鼠潜伏时间明显短于对照组、错误次数多于对照组，中、高剂量天门冬组大鼠潜伏时间长于染氟组，错误次数少于染氟组。提示，氟中毒可明显影响大鼠学习记忆能力，天门冬对氟中毒所致大鼠学习记忆障碍具有改善作用。
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