中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (5): 747-750   PDF    
引用本文
丁艳菊, 陆爽, 吴君, 程明亮. 蓝莓对大鼠肝纤维化PI3K-Akt信号通路影响[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(5): 747-750.
DING Yan-ju, LU Shuang, WU Jun, et al. Effect of blueberry on PI3K/Akt signaling pathway in rats with hepatic fibrosis[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(5): 747-750.
蓝莓对大鼠肝纤维化PI3K-Akt信号通路影响
丁艳菊, 陆爽, 吴君, 程明亮    
贵州医科大学感染病学教研室，贵州 贵阳 550004
收稿日期: 2016-02-17; 数字出版日期: 2016-5-19.
基金项目: 贵州省科技厅社会攻关项目(黔科合SY[2010]3017)
作者简介: 丁艳菊(1989-), 女, 湖北人, 硕士在读, 研究方向:肝纤维化的防治。
通讯作者: 陆爽, E-mail:Lushuang73@163.com
摘要：目的 观察磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在猪血清所致的免疫性大鼠肝组织纤维化中作用及蓝莓影响。方法 60只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、蓝莓原浆低、中、高剂量组(每天灌胃给予0.25、0.50、1.00 mL/100 g)及复方鳖甲软肝片组(每天灌胃0.054 g/100 g)，每组10只，除对照组外，其余各组均采用每周二、五腹腔注射猪血清复制大鼠肝纤维化模型，共12周；测定大鼠肝脏指数及血清丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，观察肝组织病理学改变，采用免疫组织化学、Western blot法检测肝组织Akt1、磷酸化Akt1(p-Akt1) 表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数(0.58±0.02) 明显升高(P < 0.01)，肝纤维化明显；与模型组比较，蓝莓高剂量组大鼠肝指数(0.37±0.06) 明显降低(P < 0.01)，肝纤维化程度明显减轻；与对照组比较，模型组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达量[分别为(0.99±0.09)、(0.81±0.06)]明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，蓝莓高、中剂量组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达量[分别为(0.39±0.13)、(0.42±0.15) 与(0.44±0.06)、(0.43±0.12)]明显下调(P < 0.01)。结论 蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化发生发展过程具有干预作用，其机制可能与PI3K/Akt信号通路激活有关。
关键词：蓝莓     肝纤维化     磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)     信号通路    
Effect of blueberry on PI3K/Akt signaling pathway in rats with hepatic fibrosis
DING Yan-ju, LU Shuang, WU Jun, et al     
Department of Infectious Diseases, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province 550004, China
Abstract: Objective To observe the change in phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway in rats with hepatic fibrosis induced by porcine serum immunization and to explore the effect of blueberry on the change of the signaling pathway. Methods Sixty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into a normal control group, a hepatic fibrosis model group, three blueberry treatment groups (at dosages of 0.25, 0.50, and 1.00 ml juice/100 g body weight by gavage daily), and a Compound Biejiaruangan Troche (CBT, an traditional Chinese patent medicine made mainly of Carapax Trionycis, Panax notoginseng, Radix Paeoniae Rubra, Ophiocordyceps sinensis, and Forsythia suspense, at dose of 0.054 g/100 g body weight by gavage daily).All the rats, except for those of the normal control group, were injected intraperitoneally with porcine serum twice a week(on second and fifth weekday)for 12 weeks to establish hepatic fibrosis model; the rats of blueberry and CBT group were administered, respectively, with blueberry juice and CBT simultaneously.All the rats were sacrificed by the end of 12-week treatment.Liver index, serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were determined.Pathological changes in the hepatic tissue were observed with hematoxylin-eosin (HE) staining.The expression of protein kinase B (Akt1) and phosphorylated Akt1 (p-Akt1) were detected with immunohistochemistry and Western blot. Results Compared with in the normal control group, the liver index (0.58±0.02) increased significantly (P < 0.01) and liver fibrosis was obvious in the liver fibrosis model; while, the liver index (0.37±0.06) was significantly lower (P < 0.01) and liver fibrosis was alleviated in the blueberry treatment groups compared to those in the liver fibrosis model group.Compared with hepatic fibrosis model group, the expression of Akt1 (0.99±0.09) and p-Akt1 (0.81±0.06) were significantly increased in the liver fibrosis model group (both P < 0.01) compared to those in the control group; whereas the expressions of Akt1 (0.39±0.13 and 0.42±0.15) and p-Akt1 (0.44±0.06 and 0.43±0.12) were significantly decreased in the moderate and high dose blueberry treatment groups compared to those in the liver fibrosis model group (both P < 0.01). Conclusion Blueberry can impact the development of immune hepatic fibrosis in rats and the effect may be related to the activation of PI3K/Akt signaling pathway.
Key words: blueberry     liver fibrosis     phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B     signaling pathway    

肝纤维化是由各种慢性肝损伤引起的持续伤口愈合反应所致的一种肝脏病理性改变[1]，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积为其中心环节[2]。近年来对肝纤维化形成过程中信号通路的研究倍受关注。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路就是其中重要的一条，可通过调节细胞外机质降解、HSC活化、肝窦毛细血管化等参与肝纤维化的形成[3-4]。蓝莓属杜鹃花科越桔属，小浆果类蓝色水果，因其富含花青素，多酚类和黄酮类化合物而具有降血压、抗癌、改善记忆力等作用，具有强抗氧化性[5-9]。研究表明蓝莓可增强机体抗氧化能力，抑制大鼠HSC增殖、活化及诱导HSC凋亡从而对大鼠肝纤维化发挥一定的干预作用[10-15]。本研究采用猪血清复制大鼠肝纤维化模型，观察大鼠肝组织中PI3K/Akt信号通路变化，旨在探讨蓝莓对免疫性大鼠肝纤维化干预作用及机制。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重(180±20) g，购于贵州医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(黔)2015-0001；普通饲料喂养，自然采光，自由饮水，实验前适应性喂养1周。

1.2 主要试剂与仪器

蓝莓(含有花青苷、绿原酸、黄酮素、亚麻油酸、白藜芦醇等化学成分，100 g蓝莓含总花青苷558.3 mg)由贵州省麻江县蓝莓生产基地提供，-20 ℃储存，使用时鲜榨汁[11]；复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司)；无菌猪血清(北京燕生政博生物科技有限公司)；protein kinase B(Akt1)、phosphorylated Akt1(p-Akt1) 抗体(美国Santa Cruz公司)；β-actin抗体、羊抗兔二抗(美国Abmart公司)；免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物公司)；electrochemiluminescence(ECL)化学发光试剂(成都百乐公司)。全自动荧光酶标仪(美国Beckman公司)；微量移液器(美国Eppendorf公司)；电泳仪(美国Bio-rad公司)；X射线曝光盒(北京华瑞森科技有限公司)；瞬时离心机(中国科析仪器有限公司)。

1.3 动物分组与处理

60只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组、模型组、蓝莓原浆高、中、低剂量组及阳性对照组，每组10只，除对照组外，其余各组大鼠每周二、五腹腔注射无菌猪血清，0.5 mL/只，造模同时蓝莓原浆高、中、低剂量组大鼠分别每天灌胃给予蓝莓原浆1.00、0.50、0.25 mL/100g，阳性对照组大鼠每天给予复方鳖甲软肝片(0.054 g/100g)灌胃[14]；12周末股动脉放血处死大鼠，留取血清，测定肝脏指数，取相同部位肝组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，行苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE)，剩余肝组织-80 ℃保存。

1.4 指标与方法 1.4.1 肝脏指数测定

肝脏指数=肝脏湿重/体重×100%。

1.4.2 生化指标检测

血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)采用生化分析仪按试剂盒说明书操作。

1.4.3 大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1表达定位检测

采用免疫组织化学法，大鼠肝组织切片常规脱蜡、水化，高压热修复，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育20 min，二氨基联苯胺溶液显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片，光镜下观察棕黄色区域为阳性；每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，观察阳性表达的定位及阳性表达细胞数占细胞总数的百分比。

1.4.4 大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1表达量检测

采用Western blot法，按照试剂盒说明书提取蛋白并定量，取蛋白样品40 μg，12%聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(1:200)4 ℃孵育过夜，二抗(1:10 000) 室温摇床孵育2 h，ECL曝光显影，Gel Doc EQ凝胶成像仪扫描，Quantity One软件分析结果；以β-actin作为内参照，用目标蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目标蛋白相对表达量。

1.5 统计分析

计量资料用x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，分析前先检查方差齐性，方差齐时采用最小显著差法，方差不齐时采用Tamhane′s法；等级资料采用秩和检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 蓝莓对大鼠肝脏指数及血清ALT、AST水平影响(表 1)
表 1 蓝莓对大鼠肝脏指数及血清ALT、AST水平影响(x±s，n=10)

与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数明显升高，差异统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，中、高剂量蓝莓组及阳性对照组大鼠肝脏指数明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)；各组大鼠血清ALT、AST水平无明显变化。

2.2 蓝莓对大鼠肝组织结构影响(图 1)
注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：蓝莓高、中、低剂量组；F：阳性对照(复方鳖甲软肝片)组。 图 1 蓝莓对大鼠肝组织病理学影响(HE，×40)

HE染色结果显示，对照组大鼠肝脏组织结构正常，肝小叶结构清楚，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布，汇管区及肝组织内无胶原纤维增生(图 1A)；模型组大鼠肝实质广泛破坏，肝索排列紊乱，汇管区纤维结缔组织增生，胶原纤维向肝实质延伸，分割正常肝组织，形成假小叶，纤维化明显(图 1B)；高、中剂量蓝莓组及阳性对照(复方鳖甲软肝片)组大鼠肝纤维化程度明显减轻(图 1C、D、F)；低剂量蓝莓组大鼠肝纤维化程度基本同模型组(图 1E)。

2.3 蓝莓对大鼠肝组织中Akt1、P-Akt1蛋白表达影响 2.3.1 蓝莓对大鼠肝组织中Akt1蛋白定位表达影响(图 2)
注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：蓝莓高、中、低剂量组；F：阳性对照(复方鳖甲软肝片)组。 图 2 蓝莓对大鼠肝组织中Akt1的表达影响(免疫组化)

免疫组化结果显示，对照组大鼠肝组织中有少量Akt1阳性表达或者不表达(图 2A)；模型组大鼠肝组织中Akt1阳性表达明显增加，其阳性表达位于肝细胞及间质细胞的胞浆中(图 2B)；高、中剂量蓝莓组大鼠肝组织中Akt1阳性表达较模型组明显减少(图C、D)。

2.3.2 蓝莓对大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达量影响(图 3、表 2)
注：A：对照组；B：模型组；C、D、E：蓝莓高、中、低剂量组；F：阳性对照(复方鳖甲软肝片)组。 图 3 蓝莓对大鼠肝组织Akt1、p-Akt1的表达量影响(蛋白印迹)

表 2 蓝莓对大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达水平影响(x±s，n=10)

与对照组比较，模型组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达量明显增高，差异有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，高、中剂量蓝莓组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

PI3K/Akt信号通路是一种信号级联放大反应，在细胞存活与分化、细胞生长、运动和凋亡、肿瘤等多种生理病理过程中发挥着至关重要作用[16-19]。PI3K能特异性催化磷酯酰肌醇3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇物质的激酶，募集和激活下游靶物质，从而启动一系列信号级联反应[20-21]，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)是PI3K下游的一个重要靶激酶，p-Akt是Akt的活化状态，Akt只有转化成p-Akt才能发挥生物学效应，活化的Akt进一步激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节各种生理病理过程[22]。肝纤维化导致大多数慢性肝病及并发症，一直是临床肝脏病学研究的中心环节，是一个亟待解决的难题[23]。PI3K/Akt信号通路在HSC的活化、增殖及凋亡中发挥着重要作用[24]。本研究结果显示，模型组大鼠肝组织纤维化明显，蓝莓高、中剂量组大鼠肝纤维化程度明显减轻；模型组大鼠肝组织中Akt及p-Akt蛋白水平较对照组明显增加，而蓝莓原浆高、中剂量组大鼠肝组织中Akt及p-Akt蛋白水平较模型组明显下调。提示，PI3K/Akt信号通路参与了肝纤维化的发生发展过程，蓝莓对免疫性肝纤维化过程具有一定干预作用，其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路，降低Akt及p-Akt蛋白表达水平有关。

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