中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (5): 743-746   PDF    
引用本文
王晓艳, 宋瑞瑞, 张晓雪, 沈福海, 蒋守芳, 佟俊旺, 李清钊, 田珍榛, 金玉兰. N-乙酰半胱氨酸对矽尘诱导肺泡巨噬细胞自噬影响[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(5): 743-746.
WANG Xiao-yan, SONG Rui-rui, ZHANG Xiao-xue, et al. Effect of N-acetyl-L-cysteine on expression of autophagy in rat NR8383 cells exposed to silicon dioxide[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(5): 743-746.
N-乙酰半胱氨酸对矽尘诱导肺泡巨噬细胞自噬影响
王晓艳, 宋瑞瑞, 张晓雪, 沈福海, 蒋守芳, 佟俊旺, 李清钊, 田珍榛, 金玉兰    
华北理工大学公共卫生学院, 河北 唐山 063000
收稿日期: 2015-10-26; 数字出版日期: 2016-6-21.
基金项目: 国家自然科学基金（81202161）
作者简介: 王晓艳(1989-), 女, 内蒙古人, 硕士在读, 研究方向:劳动卫生与环境卫生学。
通讯作者: 金玉兰, E-mail:13932579151@163.com
摘要：目的 探讨抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383在染尘不同时间的自噬活动影响。方法 常规培养NR8383细胞，染尘3、6、12、20、24 h，并给予NAC，分别收集细胞上清液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-βⅠ（TGF-βⅠ）表达水平，自噬水平检测采用蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光法。结果 体外巨噬细胞染尘模型最佳时间为20 h；NAC+矽尘组NR8383细胞TNF-α表达[（116.82±8.98）pg/mL]低于矽尘组[（1823.58±764.85）pg/mL]（P < 0.05）；NAC+矽尘组NR8383细胞TGF-βⅠ表达[（8.27±3.62）pg/mL]与矽尘组[（14.28±5.71）pg/mL]比较差异无统计学意义（P > 0.05）；NAC+矽尘组与矽尘组NR8383细胞LC3蛋白表达[分别为（3.52±0.57）、（3.84±0.53）pg/mL]高于对照组[（2.24±0.56）pg/mL]；免疫荧光结果显示，矽尘组NR8383细胞在20 h荧光信号强于对照组；NAC+矽尘组NR8383细胞荧光强度与矽尘组无明显差异。结论 矽尘刺激使NR8383细胞自噬表达增强；NAC可降低细胞上清液中TNF-α分泌水平，NAC可能参与染尘肺泡巨噬细胞的炎症反应过程。
关键词：N-乙酰半胱氨酸（NAC）     自噬     肿瘤坏死因子-α（TNF-α）     转化生长因子-βⅠ（TGF-βⅠ）    
Effect of N-acetyl-L-cysteine on expression of autophagy in rat NR8383 cells exposed to silicon dioxide
WANG Xiao-yan, SONG Rui-rui, ZHANG Xiao-xue, et al     
School of Public Health, North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei Province 063000, China
Abstract: Objective To assess the role of N-acetyl-L-cysteine (NAC) on the expression of autophagy in rat NR8383 cells exposed to silicon dioxide (SiO2). Methods NR8383 cells were cultured routinely and exposed to SiO2 dust (50 mg/L) for 3, 6, 12, 20, and 24 hours, respectively, and then tumor necrosis factor-α (TNF-α) and transforming growth factor-βⅠ(TGF-βⅠ) in culture supernatant were detected with double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determined the optimal time for following NAC treatment (10 mmol/L).Light chain 3 (LC3) level in NR8383 cells was determined with Western blot and immunofluorescence with confocal microscopy. Results The optimal exposure time to SiO2 dust was 20 hours in the rat NR8383 cell model.The TNF-α level in the silica exposure group with NAC treatment was significantly lower than that in the group without NAC treatment (116.82±8.98 vs.1 823.58±764.85 pg/mL, P < 0.05) but the level of TGF-βⅠwas not significantly different between the two groups (8.27±3.62 vs.14.28±5.71 pg/mL, P > 0.05).The LC3 protein levels in both the silica exposure groups with and without NAC treatment (3.52±0.57 and 3.84±0.53 pg/mL)were higher than that in the control group (2.24±0.56 pg/mL).Immunofluorescence confocal microscopy analysis demonstrated that LC3 expression in NR8383 cells with silica exposure for 20 hours was stronger than that of the control group but was not different from that of the exposure group with NAC treatment. Conclusion SiO2 can enhance autophagy in rat NR8383 cells and NAC can reduce TNF-α in cell culture supernatant, suggesting that NAC might be involved in the inflammatory response of the cells exposed to SiO2.
Key words: N-acetyl-L-cysteine     autophagy     tumor necrosis factor-α     transforming growth factor-βⅠ    

肺泡巨噬细胞是矽尘作用的主要靶细胞，细胞吞噬矽尘颗粒后，可引起细胞膜发生脂质过氧化及损伤，从而产生大量氧自由基，游离SiO2粉尘使以肺泡巨噬细胞膜为主的生物膜损伤是矽肺发病的主要原因[1-2]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是被广泛使用的抗氧化剂，能干扰活性氧，清除已经生成的自由基[3]。本研究采用游离SiO2粉尘离体刺激大鼠肺泡巨噬细胞珠NR8383细胞，NAC干预染尘NR8383细胞，通过观察细胞自噬蛋白表达，探讨NAC在染尘大鼠肺泡巨噬细胞NR8383自噬中的作用，旨在为矽肺纤维化的机制研究提供参考依据。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383) 购于美国ATCC细胞库；大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-βⅠ(transforming growth factor-βⅠ，TGF-βⅠ)试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)，F-12K培养基(美国GIBCO公司)，胎牛血清、青链霉素双抗(美国MP公司)，Alexa Fluor® 488标记羊抗兔IgG抗体(美国Life Technologies公司)，微管相关蛋白1轻链3(light chain 3, LC3) 多克隆抗体(美国Sigma公司)，山羊抗兔辣根过氧化物酶IgG抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(美国Affinity生物技术有限公司)，磷酸氯喹(chloroquine diphosphate，CDP)(日本TCI公司)；游离silicon dioxide (SiO2)粉尘(美国Sigma公司)粒径范围在0.50~10 μm，80%粒子直径在1~5 μm之间，用生理盐水配制成0.5 g/L混悬液，高压蒸汽灭菌，使用前充分混匀；N-乙酰半胱氨酸(美国Sigma公司)用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成100 mmol/L母液，4 ℃冷藏备用。FV1000激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，SpectraMax(r) M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)，FluorChemTM HD2高灵敏化学发光凝胶成像系统(美国Protein Simple公司)，Eppendorf 5424离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 指标与方法 1.2.1 染尘不同时间点细胞上清液中TNF-α和TGF-βⅠ检测

将NR8383细胞置于含有15%胎牛血清、1%青链霉素的F-12K培养液中培养。以1×106个/mL浓度将细胞接种到6孔板中，实验设对照组和矽尘组(50 mg/L)，每组4个平行样，分别孵育3、6、12、20、24 h收集细胞上清液，1 500 r/min，离心10 min，-20 ℃保存备用。实验步骤严格按照试剂盒要求进行，30 min内用酶标仪测定450 nm波长吸光度(A)值，参考波长设定为630 nm。根据细胞因子表达，选择最佳时间点，给予NAC进行干预，NAC剂量为10 mmol/L，检测NR8383细胞上清液中TNF-α和TGF-βⅠ含量。

1.2.2 NR8383细胞中LC3蛋白表达检测(激光共聚焦显微镜观察)

将细胞分为3组，即对照组、矽尘组(50 mg/L)和NAC(10 mmol/L)+矽尘(50 mg/L)组，共聚焦小皿培养20 h后，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定细胞，PBS清洗，0.2% Trion X-100处理细胞15 min后加入5%羊血清封闭，加入LC3抗体(1:200)4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，滴加荧光二抗(1:400) 室温孵育1 h，PBS洗涤3次，于激光扫描共聚焦显微镜(激发波长：495 nm，发射波长：519 nm)下观察。

1.2.3 NR8383细胞中LC3蛋白表达检测(Western blot法)

将细胞分为3组，即对照组、矽尘组、NAC+矽尘组，每组3个平行样，收集各组细胞，加入radioimmunoprecipitation assay (RIPA)细胞裂解液，冰浴放置30 min，4 ℃，12 000 g，离心10 min，收集上清，采用BCA法蛋白定量试剂盒按照说明书步骤进行蛋白定量。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，Tris-buffered saline/Triton-X100 (TBST)洗膜3次，5 min/次，electrogenerated chemiluminescence (ECL)化学发光，采用高灵敏化学发光凝胶成像系统分析蛋白表达量。

1.3 统计分析

计量资料用x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，样本均数2组比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，当差异有统计学意义时，用最小显著差法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 矽尘对NR8383细胞上清液中TNF-α和TGF-βⅠ表达影响(表 1)
表 1 染尘对NR8383细胞上清液中TNF-α及TGF-βⅠ含量影响(x±s，pg/mL，n=4)

与对照组比较，染尘12、20、24 h时，矽尘组NR8383细胞上清液中TNF-α表达量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；呈时间效应关系。与对照组比较，在染尘20、24 h时，矽尘组NR8383细胞上清液中TGF-βⅠ表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，染尘6 h后，随着时间延长，细胞上清液中TGF-βⅠ表达量逐渐升高。

2.2 NAC干预对NR8383细胞上清液中TNF-α和TGF-βⅠ表达影响

结果显示，对照组、矽尘组、NAC+矽尘组NR8383细胞上清中TNF-α含量分别为(152.79±47.53)、(1 823.58±764.85)、(116.82±8.98) pg/mL；与对照组比较，矽尘组NR8383细胞上清中TNF-α含量明显升高(P＜0.01)；与矽尘组比较，NAC+矽尘组NR8383细胞上清中TNF-α含量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组、矽尘组、NAC+矽尘组NR8383细胞上清中TGF-βⅠ含量分别为(6.28±2.37)、(14.28±5.71)、(8.27±3.62) pg/mL；与对照组比较，矽尘组NR8383细胞上清中TGF-βⅠ含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 NAC干预对NR8383细胞LC3蛋白表达影响(图 1)
注：A：对照组；B：矽尘组；C：NAC+矽尘组。绿色代表LC3的表达。 图 1 NAC干预对巨噬细胞LC3表达影响(染尘20 h，免疫荧光，×400)

结果显示，与对照组比较，矽尘组NR8383细胞LC3蛋白荧光信号增强；与矽尘组比较，NAC+矽尘组胞内荧光信号无明显变化；加入溶酶体抑制剂CDP阻断自噬降解后，各组NR8383细胞LC3蛋白表达均增强。

2.4 NAC干预对NR8383细胞LC3蛋白表达影响(图 2)
图 2 NAC干预对NR8383细胞LC3蛋白表达影响(CDP+)

结果显示，在染尘20 h时各组均未检测到LC3蛋白，表明在染尘20 h时，NR8383细胞LC3蛋白已经降解；加入溶酶体抑制剂CDP后，对照组、矽尘组、NAC+矽尘组NR8383细胞LC3蛋白表达量分别为(2.24±0.56)、(3.84±0.53)、(3.52±0.57) pg/mL：与对照组比较，矽尘组NR8383细胞LC3蛋白表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与矽尘组比较，NAC+矽尘组NR8383细胞LC3表达呈降低趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

游离二氧化硅粉尘引起肺泡巨噬细胞损伤是矽肺发生的初始环节，粉尘进入机体后，肺泡巨噬细胞将其吞噬，活化后的巨噬细胞可以合成和分泌大量细胞因子，这些细胞因子是调控肺部炎症和矽肺进展的重要活性物质[4]，其中TNF-α和TGF-βⅠ是最关键细胞因子[5-7]。TNF-α和TGF-βⅠ在肺泡巨噬细胞致炎和致纤维化中起着核心作用，TGF-βⅠ被认为是迄今最强的细胞外基质沉淀剂[8-9]，在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中，肺部纤维化的炎症反应、胶原含量及前炎症因子TNF-α、IL1β表达显著升高[10]。本研究结果显示，染尘肺泡巨噬细胞中，TNF-α和TGF-βⅠ表达在染尘20和24 h时表达量无明显差异，且20 h细胞状态较好，因此，本研究选择染尘20 h为细胞模型的染尘时间。给予抗氧化剂NAC干预后，结果显示，NAC+矽尘组NR8383细胞上清中TNF-α表达低于矽尘组，而TGF-βⅠ表达量在NAC+矽尘组与矽尘组NR8383细胞上清中无明显差异，提示NAC可能在20 h对染尘肺泡巨噬细胞中TNF-α的表达影响更大。

自噬具有保护细胞和引起细胞损伤的双重作用，是真核细胞降解胞内多余或损伤的细胞器和蛋白质的已知唯一途径[11]，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是调控自噬的重要信号分子之一。ROS在细胞内正常代谢过程中产生，包括羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等，过多ROS可损害细胞内蛋白质、脂肪、核酸及细胞器。矽肺发生过程中产生大量自由基[12]。自噬被诱导之后在激光共聚焦显微镜下可清晰的观测到LC3染色信号呈点状聚集增多[13]，微管相关蛋白LC3是自噬的一个标志蛋白[14]。本研究结果显示，矽尘组NR8383细胞自噬的荧光信号强于对照组，NAC+矽尘组与矽尘组比较荧光信号无明显差异，提示在20 h SiO2诱导肺泡巨噬细胞自噬增强，而抗氧化剂NAC的抗氧化、清除自由基作用可能在染尘20 h时与自噬的发生机制关联较弱，或虽可能参与矽尘诱导的自噬过程，但在染尘20 h时作用不明显。LC3有2种形式即Ⅰ型和Ⅱ型，LC3-Ⅰ散在分布于胞浆中，自噬被诱导之后，胞浆中均匀分布的LC3-Ⅰ与PE结合形成脂质化形式的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ定位于自噬体膜上[15]，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值在某种程度上反映了细胞的自噬强弱[16]。Western blot结果显示，与对照组比较，NAC+矽尘组NR8383细胞中LC3蛋白表达升高，与矽尘组比较无明显差异，这与激光共聚焦观察结果相吻合。

通常评估自噬活动水平是观察自噬体的数量或者检测LC3-Ⅱ含量，然而自噬体的累积也有可能由其他原因引起如自噬体成熟、降解途径受阻。因此，区别自噬的增加是由于诱导增强还是自噬过程受阻所致十分必要，自噬通量分析便是基于自噬动态检测的方法，通过比较溶酶体抑制剂存在与否情况下自噬的表达便是一种自噬通量分析方法[17]。自噬发生过程中首先形成双层膜自噬体，自噬体中包含有细胞溶质和受损细胞器自噬体，随后自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体，包裹物经溶酶体中多种蛋白酶消化和降解[18]，实现细胞物质代谢和细胞器更新[19]。本研究结果表明加入溶酶体抑制剂后，各组NR8383细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达均增强，提示自噬增强的现象是自噬本身被激活所致，并非是自噬降解途径受阻的假象。

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