2017, Vol. 33
2. 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室;
3. 昆明医科大学
黄连碱是中药黄连等植物生物碱成分之一，具有多种生物学功能，如，能改善心血管功能、保护胃粘膜、改善神经认知损伤等[1-3]，还具有抗肿瘤、抗内毒素和抗炎作用[4-7]。含有黄连碱的黄连解毒汤能降低脓毒症大鼠血清中白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等生长因子的水平，可显著逆转γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)的减少和白介素4(interleukin-4, IL-4) 的升高，并明显增强脓毒症大鼠腹腔的巨噬细胞吞噬能力[8]。黄连碱还能上调巨噬细胞呼吸相关基因表达，改变巨噬细胞膜蛋白构象，从而增强巨噬细胞免疫功能[9]。铝佐剂是应用最为广泛的一类佐剂，能够延长抗原的免疫作用时间，但诱导的细胞免疫效应差[10]。有研究表明，铝佐剂可能引起神经毒性，对人和动物造成神经功能缺陷等[11]。因黄连碱单体不稳定，本研究采用溶解性、稳定性更好的氯化黄连碱，初步研究黄连碱与氢氧化铝复合佐剂的佐剂效应，旨在探讨氢氧化铝与黄连碱复合佐剂对甲肝疫苗诱导小鼠体液免疫的影响，为新型复合佐剂的开发提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验动物6~8周龄雌性ICR小鼠49只，清洁级，体重18~22 g/只，购自中国医学科学院医学生物学研究所实验动物饲养中心，许可证号：SYXK(滇)K2014-0007。动物饲养室温度为(25±1)℃、相对湿度为(50±10)%，所有小鼠自由采食、饮水。
1.2 主要试剂与仪器甲型肝炎减毒活疫苗(抗原滴度为256 EU/mL，中国医学科学院医学生物学研究所提供)；氯化黄连碱(Cas：6020-18-4，购自中国克拉玛尔公司)；Al(OH)3胶体佐剂(29.91 mg/mL，中国医学科学院医学生物学研究所制备)；小鼠IgG ELISA试剂盒(美国KPL公司)；98%浓硫酸(重庆川东化工集团化学试剂厂)。HT6029型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；model 550酶标仪(美国Bio-RAD公司)。
1.3 分组与处理49只雌性ICR小鼠适应性观察3 d后，随机分为空白组、单纯抗原组、单纯黄连碱佐剂组、铝佐剂组及复合佐剂低、中、高剂量组，每组7只。将低剂量(25 μg)、中剂量(50 μg)、高剂量(100 μg)组的黄连碱分别与铝佐剂(300 μg)和甲型肝炎减毒活疫苗(18 EU)抗原混合作为单只小鼠的注射剂量，对复合佐剂低、中、高剂量组小鼠分别进行注射；空白对照组小鼠采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)300 μL进行注射；单纯抗原组小鼠采用甲型肝炎减毒活疫苗18EU进行注射；黄连碱佐剂组小鼠采用甲型肝炎减毒活疫苗18EU混合黄连碱50 μg进行注射；铝佐剂组小鼠采用甲型肝炎减毒活疫苗18EU混合Al(OH)3 300 μg进行注射。所有小鼠均在背部皮下进行注射，每只小鼠注射体积为300 μL。
1.4 抗HAV IgG抗体水平检测分别于注射后第4、8、12、16周采集小鼠尾静脉采血，采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测小鼠血清中抗hepatitis A virus(HAV)IgG抗体水平。按照ELISA试剂盒说明书，取甲型肝炎减毒活疫苗抗原按100 μL/孔，包被96孔板，置于湿盒，4 ℃过夜；次日，倒掉包被液，加入1×牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)，200 μL/孔，置湿盒，37 ℃温箱封闭1 h，倒掉封闭液，加入倍比稀释(起始稀释倍数为1：40) 各组的小鼠血清，100 μL/孔，37 ℃温箱孵育1 h；经1×洗液冲洗酶标板4次后，加入用1×BSA稀释至1︰1 000的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体，100 μL/孔。在37 ℃的温箱孵育1 h；经1×洗液冲洗酶标板4次后，按100 μL/孔，加入现配的2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2, 2′-azobis(3-ethyl)benzthiazoline-sulfonic acid，ABTS)显色液，避光15 min；用2 mmol H2SO4，100 μL/孔，终止显色反应；于酶标仪405/655 nm双波长法，检测各孔吸光度(A)值(cutoff值=阴参平均A值×2.1，大于cutoff值的孔判定为阳性，小于cutoff值的孔判定为阴性)，取阳性反应的最大稀释度进行抗体水平的计算。试验期间，对小鼠的毛色、精神状态、进食情况、排泄状况，注射部位有无异常等进行观察并记录。于注射后第16周ELISA试验后处死小鼠。
1.5 统计分析计量资料以x±s表示，应用Graphpad Prism 5.01软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 安全性试验实验期间，各组小鼠进食、饮水、毛色和排泄均正常，无脱毛、蜷缩、抽搐、痉挛、水肿及休克等异常现象，注射部位也均无异常。
2.2 不同组别小鼠血清中抗HAV IgG抗体水平比较(表 1)
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表 1 不同组别小鼠血清中抗HAV IgG抗体水平比较(n=49，x±s) |
在免疫后第4、8、12、16周，除空白组外，各组小鼠均能检测到抗HAV IgG抗体，且抗体水平随免疫后时间的延长均先升高而后降低；在免疫后第12周，各组小鼠血清中抗HAV IgG抗体水平达到峰值，免疫后第16周抗HAV IgG抗体水平又有所下降。在免疫后第4周，复合佐剂低剂量组小鼠抗HAV IgG抗体水平均高于单纯抗原组和单纯黄连碱佐剂组(均P＜0.05)；在免疫后第8、12、16周，复合佐剂低、中、高剂量组小鼠抗HAV IgG抗体水平均高于单纯抗原组和单纯黄连碱佐剂组(均P＜0.05)；在免疫后第12周，铝佐剂组小鼠抗HAV IgG抗体水平均高于单纯抗原组和单纯黄连碱佐剂组(均P＜0.05)；在免疫后第16周，铝佐剂组小鼠抗HAV IgG抗体水平高于单纯抗原组(P＜0.05)。
3 讨论新型佐剂研究的一个重要方向就是复合佐剂，已研发的复合佐剂可以增强单一佐剂的免疫效果，例如瑞喹莫德、聚肌胞和铝佐剂构成的复合佐剂可以明显提高口蹄疫疫苗的体液和细胞免疫应答，克服氢氧化铝佐剂对口蹄疫疫苗增强免疫应答效果不显著的缺点[12]。蜂胶和干扰素-γ复合佐剂能辅助弓形虫可溶性速殖子抗原诱导高水平的特异性抗体[13]。本实验室已开展了大量的复合佐剂研究，例如探索氢氧化铝、氢氧化锌与烟酰胺腺苷酸配比的复合佐剂对乙肝抗原诱导小鼠的免疫效应的影响，氢氧化锌与硫酸乙酰肝素适当配比的复合佐剂能否增强狂犬病疫苗诱导小鼠体液免疫等[14-15]，结果显示复合佐剂组均产生较好的免疫效果。
本研究将不同剂量的黄连碱与氢氧化铝佐剂复合，探索其作为复合佐剂候选物对甲肝疫苗诱导小鼠体液免疫效应的影响。结果显示，在免疫后第4、8周，一定剂量配比的氢氧化铝与黄连碱复合佐剂能明显增强甲肝抗原诱导的体液免疫，与同剂量单纯铝佐剂和单纯黄连碱相比，增强效果更为迅速。免疫后第12、16周，增强的抗体水平可保持较高的水平，与铝佐剂相当。同时，低剂量的黄连碱与氢氧化铝复合佐剂增强体液免疫的作用较中、高剂量组黄连碱复合佐剂更快，推测免疫效果与黄连碱剂量存在相关性。
综上所述，本研究初步证实了黄连碱与氢氧化铝复合后对甲肝抗原诱导小鼠的体液免疫有快速增强的效果，即黄连碱能加速铝佐剂的免疫增强效应，有望开发为新型人用复合佐剂。
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