中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (4): 611-613   PDF    
引用本文
李诺, 任雪丹, 吕中明, 王民生. DEHP亚慢性暴露对大鼠精子运动参数影响[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(4): 611-613.
LI Nuo, REN Xue-dan, LV Zhong-ming, et al. Effect of low dose DEHP exposure on motility parameters of rat sperm in vitro[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(4): 611-613.
DEHP亚慢性暴露对大鼠精子运动参数影响
李诺1,2, 任雪丹1,2, 吕中明1,2, 王民生1,2     
1. 东南大学公共卫生学院, 江苏 南京 210000;
2. 江苏省疾病预防控制中心毒理与功能评价所
收稿日期: 2017-01-23; 数字出版日期: 2017-03-29.
基金项目: 东南大学环境医学工程教育部重点实验室开放课题(2015EME002)；中央高校基本科研业务费专项资金资助和江苏省普通高校研究生科研创新计划(SJZZ15_0026)
作者简介: 李诺(1991-)，女，山东高密人，硕士在读，研究方向：卫生毒理学。
通讯作者: 吕中明, E-mail:luzhongming@jscdc.cn
王民生, E-mail:wangms@jscdc.cn
摘要： 目的 观察邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)染毒90 d对大鼠精子运动能力的毒性作用。 方法 将健康清洁级SD雄性大鼠40只随机分为对照组和3个DEHP染毒组(5、50、500 mg/kg)，进行90 d经口染毒；取睾丸、附睾称重，并用扩散法收集大鼠附睾尾精子，应用计算机辅助精子分析系统(CASA)对精子的运动参数进行检测。 结果 5 mg/kg DEHP组大鼠精子直线性(LIN)为(44.00±2.52)%，明显低于对照组(50.00±2.71)%(P < 0.05)；500 mg/kg DEHP组大鼠精子鞭打频率(BCF)为(5.8±4.2) Hz，明显低于对照组(10.4±1.7) Hz(P < 0.05)；与对照组比较，500 mg/kg DEHP组大鼠精子的平均路径速度(VAP)、直线运动速度(VSL)、曲线运动速度(VCL)、精子头侧摆幅度(ALH)、BCF明显下降，差异均有统计学意义(均P < 0.05)；随着DEHP染毒浓度增加，大鼠精子各项运动参数逐渐降低，精子的运动能力下降。 结论 DEHP对大鼠附睾精子的运动能力有直接毒性作用。
关键词： 邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)     精子     计算机辅助精子分析系统(CASA)    
Effect of low dose DEHP exposure on motility parameters of rat sperm in vitro
LI Nuo, REN Xue-dan, LV Zhong-ming, et al     
School of Public Health, Southeast University, Nanjing, Jiangsu Province 210000, China
Abstract: Objective To observe the toxic effect of 90 days′ di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) exposure on motility of rat sperm. Methods Forty male Sprague-Dawley (SD) rats of clean grade were randomly divided into a control and a DEHP exposure group.The rats of the exposure group were treated with DEHP at the doses of 5, 50 and 500 mg/kg orally for 90 days continuously.Testis and epididymis of all the rats were weighed and then the epididymis was collected with 'diffusion' method by the end of the treatment.Effects of DEHP on the motility of isolated sperms were analyzed with computer assisted sperm analysis (CASA) system. Results The percentage linearity(LIN)of the sperms of rats exposed to 5 mg/kg DEHP was significantly lower that those of the control rats (44.00±2.52% vs.50.00±2.71%, P < 0.05).The beat cross frequency(BCF) of the sperms of rats exposed to 500 mg/kg DEHP was significantly lower that that of the control rats (5.8±4.2 Hz vs.10.4±1.7 Hz, P < 0.05).All the motility parameters of sperms of the rats treated with 500 mg/kg DEHP reduced significantly compared with those of the controls (P < 0.05 or P < 0.01).With the increase of DEHP concentration, the parameters of sperm motility decreased. Conclusion The results demonstrate that DEHP exposure could result in direct toxic effects on motility of sperms in caudal epididymides of rats.
Key words: di-(2-ethylhexyl)phthalate     sperm     computer assisted sperm analysis    

邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]属于邻苯二甲酸酯类化合物(phthalic acid ester, PAE)，是目前应用最广泛的增塑剂之一。由于DEHP与产品基质间为非共价结合，随着时间推移，DEHP容易从产品中释放到周围环境造成污染，并通过饮水、摄食和呼吸等多种途径进入生物体，最终对环境和生物体健康造成危害。研究表明DEHP可对多种组织和器官产生毒性，而生殖系统是DEHP毒性作用的主要靶器官，DEHP对雄性生殖系统的影响是诱导睾丸、附睾等组织器官发生结构和功能上退行性变化，主要表现为睾丸萎缩、重量下降；精母细胞、精子数量下降；曲细精管直径缩小；睾丸支持细胞结构破坏；附睾精子密度和活力下降、精子畸形率升高等[1-5]。DEHP对雄性生殖系统最直接的影响体现在对其精子质量的损害，而精子的运动能力能够综合反映精子的质量。计算机辅助精子分析系统(computer assisted sperm analysis, CASA)是一项对精子运动图像进行自动化处理并能够客观地评价精子运动能力的技术，可快速准确地测定精子的运动速度和运动方式，可克服传统方法耗时长，获取的信息量少以及准确度低等缺点[6-8]。本研究应用CASA定量分析DEHP对大鼠精子运动参数的影响。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

version 12 TOXIVOS CASA仪(美国Hamilton Thorne Biosciences公司)；DEHP，纯度≥99.5%(美国Sigma公司)，M199培养基(美国GIBCO公司)，牛血清白蛋白(组分Ⅴ，Lot:LJ0224B2010J，加拿大Bio Basic Inc公司)。

1.2 实验动物

选择健康的清洁级雄性SD大鼠40只，体重为70~90 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，质量合格证编号：11400700158173。饲养于屏障环境动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2012-0037。动物实验室温度控制在20~26 ℃，湿度为40%~70%；单笼饲养，适应性饲养3 d后开始实验。

1.3 分组与处理

将大鼠按体重随机分为4组，每组10只，分别为对照组及3个DEHP染毒组(染毒剂量分别为5、50、500 mg/kg)，各剂量组按相应比例将DEHP均匀拌入饲料中，颗粒饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司加工，将饲料按组别以平均每日动物体重8%的摄食量给予大鼠，连续饲喂染毒90 d。每天观察大鼠一般情况(一般表现、行为、中毒表现和死亡情况等)；每周记录1次体重和2次摄食量，并计算总的食物利用率(总食物利用率=总增重/总摄食量×100%)。染毒期间，大鼠可自由饮水、取食。

1.4 指标与方法 1.4.1 脏器重量及脏/体比值测定

大鼠空腹16 h后称量体重，采血后处死大鼠，迅速分离取出大鼠双侧睾丸和附睾，称重并计算脏/体比值(脏/体比值=脏器重量/体重×100%)。

1.4.2 精子悬液制备

分别于每组随机选取6~8只性成熟大鼠，在大鼠处死后立即分离双侧附睾尾，在内含12 mL M199培养液(已于37 ℃预温)的塑料培养皿中，用手术刀沿附睾尾纵切4~5刀后，将该培养皿置于CO2培养箱中5 min，让精子得以扩散并从附睾尾中游离出来，用尖头镊子移出残余组织，制成精子浓度为2.0×107个/mL的精子悬液。使用显微镜玻片吸取位于上层活精子悬液，避免碰触到悬液底部，之后用CASA仪对精子的运动轨迹进行分析。

1.4.3 主要分析参数

用CASA仪对精子的直线运动速度(straightline velocity，VSL)、曲线运动速度(curvilinear velocity，VCL)、平均路径速度(average velocity，VAP)(μm/s)、精子头侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement，ALH)(pan)、直线性(percentage linearity，LIN)、前向性(percentage straightness，STR)(%)、鞭打频率(beat cross frequency，BCF)(Hz)及精子头长宽比(elongation，ELON)(%)等进行测定，每份样品分析200个轨迹，记录20个视野，用时约20 s。CASA仪主要参数按照说明书进行设定。

1.5 统计分析

数据用x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，多组间均数比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，组间两两比较用Scheffe检验和最小显著差法检验；率的比较采用非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DEHP对大鼠一般状况影响(表 1)
表 1 DEHP染毒对大鼠体重、脏器重量和脏器系数影响(x±s，n=10)

在染毒期间，各组大鼠均未出现明显异常现象；随着DEHP染毒剂量增加，大鼠睾丸及附睾的重量明显下降，与对照组比较，500 mg/kg组大鼠附睾重量和附睾系数明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。

2.2 DEHP对大鼠精子运动能力影响(表 2)
表 2 DEHP染毒对大鼠精子运动能力影响(x±s)

与对照组比较，5 mg/kg DEHP组大鼠精子运动的LIN下降(P < 0.05)，500 mg/kg DEHP组大鼠精子VAP、VSL、VCL、ALH及BCF明显下降，差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.3 DEHP对大鼠精子运动状态影响(表 3)
表 3 DEHP染毒对精子运动状态影响(x±s)

与对照组比较，500 mg/kg DEHP组大鼠有活力精子百分比、运动前向性精子百分比和运动快速精子百分比明显降低，而静止精子百分比明显升高，差异均有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

运动能力是精子独有的特征，不仅能够直观地反映精子质量，还能够间接地反映精子的受精能力[9]。而目前研究DEHP雄性生殖毒性常用的观察指标为器官重量与脏体比、组织病理学检查、生化检测、内分泌激素及精子计数、精子存活率、畸形率、活动率等，对精子运动能力进行客观评价的研究较少。精子的运动能力包括精子运动活力、运动速度与精子的运动方式[3、10-11]。CASA是应用计算机的图像分析系统对精子的运动速度及运动方式进行数字化处理，能够提供一系列精子动力学参数的量化数据，可对精子的运动能力进行快速的科学客观的综合评价[12]，适用于大鼠等实验动物的精子检测[13]。

研究表明运动参数中的VSL、STR和LIN指标对化学物质的染毒剂量尤为敏感，是判断化学物引起雄性大鼠生殖毒性的重要指标[14]。本研究结果显示，5 mg/kg DEHP组大鼠精子运动直线性下降，随染毒剂量增加，精子运动参数VAP、VSL、VCL、ALH和BCF也均有所降低，呈现一定剂量-效应关系。提示，DEHP对大鼠精子运动速度和直线性均有明显影响，DEHP对大鼠附睾尾精子有直接毒性作用。Hirano等[15]应用CASA系统研究精子运动特征和受精率之间的关系，发现影响精子受精率的特异性指标为VCL和快速运动的精子比例。本研究结果表明大鼠精子VCL和运动快速精子百分比随着DEHP染毒剂量增加不断下降。提示，DEHP对大鼠精子的受精能力亦可能有直接损害。

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