2017, Vol. 33
2. 青海大学包虫病重点实验室
棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病，是一种危害严重、呈世界性分布的人兽共患性寄生虫病，中国属高发地区之一。目前对于包虫病的免疫学诊断所用抗原是通过粗提原头节、囊液蛋白而获得，虽具有较高的敏感性和特异性[1]，但抗原成分复杂，易发生过敏反应，且抗原来源困难，不利于大规模生产，限制其在临床应用。从棘球蚴原头节、囊液中筛选出具有特异性的抗原，通过基因工程技术大规模合成有望成为今后的发展方向。而抗原表位是抗原分子抗原性的基础，因此预测抗原分子的抗原表位，是寻找特异性抗原分子有效的方法。确定抗原表位常用的技术有X射线衍射与核磁共振分析、实验技术、生物信息学技术[2-3]，前两者具有很高的准确性但成本昂贵，技术要求高，而通过生物信息学技术预测抗原表位，不仅可节省大量经费及时间，其预测准确性也随着生物信息学的发展而不断提高。有研究发现，延伸因子1(elongation factor 1，EF-1) 是一种具有潜在诊断价值的抗原[4-5]，本研究通过生物信息学技术对其进行分析，旨在了解EF-1在细粒棘球绦虫的免疫学诊断价值。
1 材料与方法 1.1 基因及氨基酸序列查询GenBank并经BLAST比对确定EF-1基因序列，采用网站自动翻译的氨基酸序列用来后续分析。
1.2 理化性质推测EF-1的理化性质预测使用Expasy系统的protparam数据库(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)。使用DNAStar软件Kyte-Doolittle法，预测EF-1亲水性；Karplus-Schulz法预测EF-1柔性区域；Jameson-Wolf法预测EF-1抗原性指数；Plot-Emini法预测EF-1表面可及性。
1.3 B、T细胞表位预测利用ABCpred在线软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)及IEDB软件(http://tools.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.html)综合预测EF-1 B表位，选取2者重叠部分中可能形成B细胞表位的部分。为提高预测准确性，ABCpred只保留得分≥0.8的结果，IEDB软件预测结果中只保留长度 > 7的结果。应用DNAStar软件AMPHI法预测Th细胞抗原表位、Rothbard-Taylor预测含特定基序(motif)的T淋巴细胞抗原表位，综合2种预测结果推测优势性T细胞表位。
1.4 二、三级结构预测二级结构预测使用SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)，三级结构预测运用SWISS-MODEL网站(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模方法，进行自动建模。
1.5 EF-1氨基酸序列同源性分析从GenBank中下载部分绦虫EF-1的氨基酸序列、使用MEGA软件选择neighbor joining法构建系统发育树。
2 结果 2.1 EF-1基因及氨基酸序列EF-1基因序列(No.AB306934) 全长1 412 bp，含有2个内含子(1~144、745~776)，网站自动翻译的氨基酸序列(No.BAF63675) 由448个氨基酸残基组成。通过protparam数据库预测得到EF-1相对分子量为48 856.7 kDa，等电点pI为9.23，半衰期为30 h(mammalian)、 > 20 h(yeast)、 > 10 h(E.coli)，不稳定指数为28.32(为稳定蛋白)。
2.2 EF-1蛋白亲水性、柔性区域、抗原指数及表面可及性(图 1)
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图 1 DNAStar软件预测的EF-1蛋白亲水性、柔性区域、抗原指数及表面可及性 |
Kyte-Doolittle法预测的EF-1亲水性得分较高的区域为35~45、52~70、126~140、158~183、301~322、357~380、424~448；Karplus-Schulz法预测的柔性区域散在分布，较大的几个区域为26~45、54~71、162~176、300~318、357~381、432~448；Jameson-Wolf法预测的抗原性指数得分较高的区域分布与Karplus-Schulz法预测的柔性区域一致；Plot-Emini法预测的表面可及性得分较高的区域较少，主要分布在39~54、62~76、128~132、161~170、220~234、315~329、354~372、424~448。
2.3 B细胞表位预测(图 2)
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图 2 IEDB软件预测的EF-1 B细胞表位 |
通过ABCpred软件，得到的可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列区域为87~103、114~130、146~162、187~203、253~269、279~295、304~320、330~346、336~352、362~378、377~393，IEDB软件预测的区域为17~24、41~52、120~134、198~210、221~231、286~296、306~325、365~383，两者重叠区域中可能形成B细胞线性表位的氨基酸序列为：120~130、286~295、306~320、365~378。
2.4 T细胞表位预测AMPHI法预测可能形成T细胞表位的区域为15~22、34~49、82~92、97~106、163~175、212~251、258~266、280~290、367~378、397~408；Rothbard-Taylor法预测可能的T淋巴细胞抗原表位为36~51、94~101、155~162、172~179、181~188、217~224、236~242、281~291、321~330、349~355、356~362、398~405、420~428，取两者重叠部分，得到可能的优势性T细胞表位区域为34~48、164~177、222~244、280~290、321~330、396~407。
2.5 二、三级结构(图 3)
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图 3 SWISS-MODEL网站构建的EF-1三级结构 |
SOPMA在线软件预测的EF-1二级结构中α螺旋占32.81%、β折叠占22.54%、β转角占10.94%、无规则卷曲占33.71%，SWISS-MODEL网站预测的EF-1的三级结构见图 3。
2.6 EF-1基因同源性分析(图 4)
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图 4 MEGA软件构建的EF-1的neighbor joining系统发育树 |
从构建的系统发育树来看，EF-1具有较高的保守性，除多房棘球绦虫外，其他聚于一枝，并且在这枝内部形成梳齿状分枝，人作为外类群单独处于一枝。
3 讨论EF-1是一种多聚体核糖体蛋白质，在细胞内普遍存在且大量表达，真核细胞可能有α、β、γ、δ 4个亚基。其中α亚基属G蛋白家族，与鸟苷酸结合调节蛋白(guanine nucleotide-binding regulatoryprotein，GTP)、氨基酰-tRNA组成复合体，促进氨基酰-tRNA进入氨基酰位，EF-1β具有GTP酶活性，在EF-1α从核糖体脱落构象由GDP变为GTP准备结合新氨基酰-tRNA的过程中起催化作用，γ亚基常与β亚基形成复合物，可提高β亚基的GTP酶活性[6-7]。有研究发现，在脊椎动物中还有δ亚基，其C端与β亚基具有同源性，但N端没有，提示，它们可能执行着不同功能[8]。
生物信息学是由生物学、计算机和信息论等融合而成的一门学科，组织和存储了海量由基因遗传学、分子生物学和生物技术推动的生物信息[9]。已在药物设计、蛋白结构预测，表位疫苗预测等方面得到广泛应用。随着理论和技术的积累，大量蛋白、抗原表位数据库得以建立，如MHC配体和多肽基序的数据库SYFPEITHI、欧洲蛋白序列数据库(Swiss-Prot Protein Sequence Database，SWISS-PROT)、免疫表位数据库(immune epitope database，IEDB)、B细胞表位预测数据库(prediction of linear B-cell epitopes，Bcepred)等，预测结果精确度不断提高，使得通过生物信息学技术预测蛋白结构、抗原表位成为及时高效的手段。
抗原表位是指免疫应答过程中被特异的效应分子或B、T淋巴细胞识别的抗原分子中具有特殊结构与免疫活性的化学基团，根据所结合细胞的不同，分为B细胞表位和T细胞表位[10-11]。B细胞表位多为亲水性氨基酸或单糖残基，常位于抗原分子表面，而T细胞表位常为隐藏于抗原内部的疏水性肽段[2]。抗原表位决定着抗原分子的抗原性，研究抗原分子的抗原表位，对诊断试剂的制备、多肽疫苗的合成、单克隆抗体的筛选具有重要意义[12]。
对于B细胞线性表位的预测主要通过蛋白亲水性、柔性区域、抗原指数、表面可及性、二级结构综合来推测可能形成结合抗原的区域[13-16]，亲水性区域位于抗原表面与B细胞表位关系密切。本研究结果显示，EF-1蛋白亲水性区域占50%以上，柔性区域的分布与抗原指数的分布区域一致，占60%以上，这为EF-1形成B细胞抗原表位提供了有利条件；表面可及性分布的区域较少提示，EF-1也可能形成构象表位。结合ABCpred和IEDB软件分析的结果得到可能形成B细胞抗原表位区域为：120~130、286~295、306~320、365~378，与抗原指数得分较高的区域分布有较大的重叠区域。研究表明二级结构中，α螺旋、β折叠常位于抗原内部，形态固定，结构规则，不利于抗体结合，而β转角和无规则卷曲位于抗原的表面，利于抗体结合，易于形成抗原表位[17]。SOPMA在线软件预测的EF-1二级结构中β转角占10.94%、无规则卷曲33.71%，为形成B细胞抗原表位提供了有利条件；EF-1三级结构中有较多的无规则卷曲，为形成B细胞线性表位提供了可能。
T细胞表位常位于抗原内部的疏水性区域。本研究结合AMPHI与Rothbard-Taylor的预测结果，得到EF-1可能的优势性T细胞表位区域为34~48、164~177、222~244、280~290、321~330、396~407，由亲水性预测结果来看，这些区域多分布在得分为负值的疏水性区域，结果较为准确。从构建的系统发育树来看，EF-1具有较高的保守性，除多房棘球绦虫外，其他均聚在一枝，并在这枝内部呈现梳齿状分枝。提示，EF-1在棘球绦虫与其他绦虫之间存在种属差异，利用这种差异，寻找细粒棘球绦虫EF-1特有表位，可为设计表位抗原疫苗提供新的选择[18-19]。
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