中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (4): 596-598   PDF    
引用本文
安方玉, 刘雪松, 颜春鲁, 骆亚莉, 刘永琦, 史旭锋, 刘兴吉. 黄芪总皂苷对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制作用及机制[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(4): 596-598.
AN Fang-yu, LIU Xue-song, YAN Chun-lu, et al. Inhibitive effect of total astragalus saponin on tumor and its mechanism in H22-bearing mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(4): 596-598.
黄芪总皂苷对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制作用及机制
安方玉1, 刘雪松1, 颜春鲁1, 骆亚莉1, 刘永琦1,2, 史旭锋3, 刘兴吉3     
1. 甘肃中医学院 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室, 甘肃 兰州 730000;
2. 敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室;
3. 甘肃中医药大学临床学院
收稿日期: 2016-04-21; 数字出版日期: 2016-08-10.
基金项目: 2012年甘肃省科技支撑计划（1204FKCA169）；甘肃中医药大学中西医结合重点学科基金；甘肃中医药大学学生创新基金
作者简介: 安方玉(1977-), 女, 讲师, 硕士, 研究方向:生物化学和中药抗瘤的分子生物学机制。
通讯作者: 刘永琦, E-mail:lyq@gszy.edu.cn
摘要： 目的 探讨黄芪总皂苷对小鼠肝癌H22肿瘤生长及免疫功能影响。 方法 建立小鼠肝癌H22移植瘤模型，小鼠随机分为对照组、模型组、黄芪总皂苷高、中、低剂量组；称重法检测小鼠抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数；噻唑蓝法检测小鼠淋巴细胞增殖能力及T淋巴细胞转化能力，酶联免疫法检测小鼠血清中白细胞介素-2（IL-2）含量。 结果 与对照组比较，模型组小鼠体重[（24.90±2.82）g]明显减轻，胸腺、脾脏指数[分别为（1.47±0.45）、（3.97±0.05）mg/g]明显下降，淋巴细胞增殖能力（0.10±0.02）及转化能力[（1.08±0.03）%]明显降低，血清IL-2含量[（87.59±28.60）pg/mL]明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪总皂苷各剂量组小鼠肿瘤生长均明显受到抑制，黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠胸腺与脾脏指数[分别为（2.18±0.34/）、（2.47±0.54/）、（2.51±0.46/）与（5.42±0.84）、（6.13±0.71）、（6.46±0.85）mg/g]升高，淋巴细胞增殖能力[分别为（0.17±0.01）、（0.18±0.03）、（0.19±0.01）]和T淋巴细胞转化能力[分别为（1.14±0.07）、（1.15±0.06）、（1.20±0.07）%]增强，血清IL-2含量[分别为（117.67±30.28）、（121.80±34.04）、（124.93±37.10）pg/mL]升高。 结论 黄芪总皂苷可抑制小鼠肝癌H22肿瘤细胞的增殖，其机制可能与增强机体的免疫功能有关。
关键词： 黄芪总皂苷     H22苛瘤小鼠     肿瘤抑制     免疫功能    
Inhibitive effect of total astragalus saponin on tumor and its mechanism in H22-bearing mice
AN Fang-yu, LIU Xue-song, YAN Chun-lu, et al     
Gansu Provincial Key Laboratory for Molecular Medicine and Traditional Chinese Medicine for Major Diseases Prevention and Treatment, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou, Gansu Province 730000, China
Abstract: Objective To investigate the effect of different concentration of total astragalus saponin on the growth of tumor cells and immune function in H22-bearing mice. Methods The H22 liver tumor model was established and the H22-bearing mice were randomly divided into a tumor bearing model group, low-, medium-, and high-dose total astragalus saponin treatment groups; a control group was also set.At the end of 10 day's treatment, tumor inhibition ratio, spleen index, and thymus index of all the mice were determined with weighing method; multiplication capacity of lymphocytes and the transformation ability of T lymphocytes were tested with 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay; meanwhile, interleukin-2 (IL-2) content was detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with those in the control group, the body weight (24.90±2.82 g), thymus index (1.47±0.45 mg/g), and spleen index (3.97±0.05 mg/g) decreased significantly in the model group (P < 0.05 for all); the lymphocyte multiplication capacity (0.10±0.02) and the T lymphocyte transformation ability (1.08±0.03) declined obviously in the model group (both P < 0.01);the IL-2 content (87.59±28.60 pg/ml) was significantly down-regulated in the model group (P < 0.01).Compared to that in the model group, the growth of tumor in total astragalus saponin treatment groups was obvious inhibited (P < 0.01).For the mice of low-, medium-, and high-dose total astragalus saponin treatment groups, the thymus index (2.18±0.34, 2.47±0.54, and 2.51±0.46 mg/g), the spleen index (1.14±0.07, 6.13±0.71, and 6.46±0.85 mg/g), the capacity of lymphocyte multiplication (0.17±0.01, 0.18±0.03, and 0.19±0.01), the lymphocyte transformation (5.42±0.84, 1.15±0.06, and 1.20±0.07), and the content of IL-2 (117.67±30.28, 121.80±34.04, and 124.93±37.10 pg/ml) were all higher than those of the model group. Conclusion The total astragalus saponin could inhibit the proliferation of tumor cells in H22-bearing mice and the mechanism of the inhibitive effect may be related to increased immune function.
Key words: total saponin of astragalosides     H22 tumor-bearing mice     tumor suppression     immune function    

肝癌是一种严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一。其中，肝细胞癌约占90%。肝癌具有发病急、发现迟、恶性程度高等特点。目前，治疗肝癌的手段为化疗、放疗及手术切除等，其中手术切除是根治肝癌最有效和最彻底的手段。但很多肝癌患者在发现肿瘤时已经进入中、晚期阶段，丧失了最佳的治疗时期。而保守治疗所带来的各种副作用则成为肝癌患者丧失生命的主要因素之一[1]。黄芪是传统的益气类中药，有补气固表、利尿脱毒、敛疮生肌、补中益气之功效。近年来，相关研究发现，黄芪的有效成分总皂苷可发挥抗疲劳、抗纤维化、抗氧化、抗癌等作用[2-5]，但抗肿瘤机制尚未明确。因此，本研究通过不同剂量的黄芪总皂苷干预肝癌H22移植瘤小鼠，观察其对小鼠肿瘤生长及免疫功能的影响，探讨其抗肿瘤作用机制。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级昆明种小鼠50只，6~8周龄，体重(20±2) g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 主要试剂与仪器

黄芪总皂苷，纯度98%(南京泽朗医药科技有限公司，批号：ZL20130511YY)，用生理盐水配制成80 mg/mL储备液；环磷酰胺(山西普德药业股份有限公司，批号：04121003)，临用前用生理盐水配制成1 mg/mL溶液备用；刀豆蛋白A(美国Sigma公司)，噻唑蓝[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diaphenyltetrazolium bromide, MTT](美国Spectrum Chemical公司)，鼠白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2) precoated酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) kit(北京达科为生物技术有限公司)。9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)。

1.3 动物分组与处理

50只小鼠随机取10只作为对照组，另外40只小鼠用于制备腹水瘤模型；将接种H22瘤种8 d的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下抽取腹水瘤细胞悬液5 mL，800 r/min，离心5 min，磷酸缓冲盐溶(phosphate buffer saline，PBS)洗涤后，用生理盐水调整细胞浓度为1×106个/mL，以每只0.2 mL接种于小鼠右腋皮下，24 h后，将小鼠随机分为4组，分别为模型组、黄芪总皂苷高、中、低剂量组，每组10只；模型组和对照组灌胃等体积生理盐水；黄芪总皂苷高、中、低剂量组分别灌胃给予1 600、800、400 mg/kg黄芪总皂苷；连续10 d。

1.4 指标与方法 1.4.1 小鼠体重及免疫器官指数、抑瘤率测定

末次给药24 h后，称量并记录小鼠体重，眼球采血处死小鼠，摘取脾脏、胸腺和肿瘤组织称重，分别计算抑瘤率、脾脏指数及胸腺指数。抑瘤率=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%；胸腺(脾脏)指数=胸腺(脾脏)质量(mg)/体重(g)。

1.4.2 淋巴细胞增殖实验

制备脾淋巴细胞悬液，用1640完全培养基调整细胞数为1×106个/mL，按照100 μL/孔加在96孔中，37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养24、48、72 h。培养结束前4 h，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，每孔加入100 μL三联裂解液溶解，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，于酶标仪波长570 nm处检测吸光度(A)值。

1.4.3 T淋巴细胞转化实验

制备脾淋巴细胞悬液，分别设置对照孔和concanavalin A (ConA)刺激孔，对照孔加入10 μL的1640完全培养基和100 μL/孔脾淋巴细胞悬液；ConA刺激孔加入10 μL ConA(终浓度为5 μg/mL)和100 μL/孔脾淋巴细胞悬液；设3个复孔。37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养68 h后，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，每孔加入100 μL三联裂解液溶解，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，于酶标仪波长570 nm处检测吸光度(A)值。按照下列公式计算T淋巴细胞转化刺激指数(stimulation index, SI)=ConA孔A值/对照孔A值×100%。

1.4.4 血清中IL-2含量测定

小鼠眼球取血，室温静置2 h，1 500 r/min，离心10 min，分离血清，用试剂盒测定血清中IL-2含量；具体操作严格按照试剂盒说明进行。

1.5 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 14.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用最小显著差法，方差不齐采用Dunnet t分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 黄芪总皂苷对荷瘤小鼠体重及免疫器官指数影响(表 1)
表 1 黄芪总皂苷对荷瘤小鼠体重及免疫器官指数影响(x±s，n=10)

结果显示，与对照组比较，模型组小鼠体重及胸腺、脾脏指数均明显降低(P＜0.05)；与模型组比较，各剂量黄芪总皂苷组小鼠胸腺、脾脏指数均升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 黄芪总皂苷对荷瘤小鼠肿瘤生长影响

结果显示，模型组、黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠瘤质量分别为(1.22±0.10)、(0.72±0.09)、(0.62±0.09)、(0.58±0.08) g；与模型组比较，各剂量黄芪总皂苷组小鼠瘤质量均明显减轻，差异具有统计学意义(P＜0.01)；黄芪总皂苷低、中、高剂量组小鼠抑瘤率分别为41%、49%、53%。

2.3 黄芪总皂苷对荷瘤小鼠免疫功能影响(表 2)
表 2 黄芪总皂苷对荷瘤小鼠免疫功能影响(x±s，n=10)

结果显示，与对照组比较，模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力、淋巴细胞转化能力、血清IL-2含量均明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，各剂量黄芪总皂苷组小鼠脾淋巴细胞增殖能力、淋巴细胞转化能力、血清IL-2含量均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。

3 讨论

胸腺是重要的中枢免疫器官，其分泌的细胞因子能够促进T细胞成熟，是T淋巴细胞分化成熟的主要场所，在免疫调节中具有重要作用[6]。胸腺重量及大小可反映机体免疫细胞的数量和能力。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，主要富含T、B淋巴细胞，是合成免疫活性物质和参与免疫应答的主要场所。研究中常用胸腺(脾)指数的改变来间接反映机体免疫功能的状态[7]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠胸腺、脾脏指数明显下降；而各剂量黄芪总皂苷组小鼠胸腺、脾脏指数均明显高于模型组(P＜0.01)。提示，黄芪总皂苷可能通过提高小鼠免疫功能从而抑制肿瘤的生长。

T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞，在胸腺激素诱导下，骨髓中的多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞，主要介导细胞免疫应答。而淋巴细胞活化的重要特征之一是受抗原刺激后的增殖。因此，淋巴细胞增殖实验是评价淋巴细胞功能的重要指标[8]。IL-2是一种由T淋巴细胞分泌的、在调节免疫反应中起重要作用的细胞因子，可以促进T淋巴细胞的增殖[9-10]。IL-2降低是肿瘤患者细胞免疫功能受损的重要标志。本研究结果表明，与对照组比较，模型组小鼠淋巴细胞的增殖能力及T淋巴细胞的转化能力均降低，小鼠血清中IL-2含量也明显降低，表明苛瘤小鼠免疫功能受损；与模型组比较，各剂量黄芪总皂苷组小鼠淋巴细胞的增殖能力、T淋巴细胞的转化能力及小鼠血清中IL-2含量均明显增加。提示，黄芪总皂苷在肿瘤免疫中可能起着一定的调节作用，这可能是黄芪总皂苷抑制肿瘤生长作用机制之一。

参考文献
[1] 田乃旭, 屠鹏飞. 药物学研究与展望[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 1999: 2-5.
[2] 冯毅翀, 许金叶, 赵自明, 等. 黄芪总皂苷对运动性疲劳大鼠海马功能和形态的影响[J]. 中医杂志, 2014, 55(50): 420–423.
[3] 王文祥, 熊晓滨. 黄芪总皂苷提取物对牛血清白蛋白致大鼠肝纤维化作用的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(9): 277–280.
[4] 韩冬, 张余威, 刘苗, 等. 黄芪总皂苷对心室重构大鼠血流动力学及抗氧化作用的影响[J]. 中国实验诊断学, 2013, 17(11): 1956–1959.
[5] 蔡翊, 王群伟. 黄芪总皂苷抗肝癌活性研究[J]. 中国现代医学杂志, 2011, 21(34): 4258–4260. DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2011.34.008
[6] 白雪, 关宝生, 孙艳男, 等. 八月札水提物对H22肝癌荷瘤鼠免疫功能的影响[J]. 中国老年学杂志, 2015, 43(5): 1946–1948.
[7] 代海华, 宋扬, 陈丹丹, 等. 刺参酸性黏多糖对5-FU治疗小鼠肝癌的减毒增效作用[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2015, 22(1): 23–27.
[8] 曹秀明, 杨菲菲, 李婧, 等. D-氨基葡萄糖盐酸盐对小鼠淋巴细胞增殖及相关基因表达的影响[J]. 高师理科学刊, 2011, 31(5): 59–62.
[9] 安方玉, 刘永琦, 骆雅莉, 等. 当归不同有效部位对高原低氧模型小鼠免疫功能的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2015, 22(2): 51–54.
[10] 李静, 彭瑞云, 张静, 等. 安多霖对微波辐射致大鼠免疫损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(10): 1269–1270. DOI:10.11847/zgggws-2011-27-10-21