铅(lead, Pb)是常见的工业污染物之一，可在人体和动物组织中蓄积，在人体内不易降解，分布极为广泛^[1]，极低的浓度便可对人体产生毒害。国内外研究表明，Pb能够干扰人体神经、骨骼、免疫等多组织器官的正常代谢和功能运转^[2]。铅在人体最主要的靶器官是骨骼，它进入机体后，最终95%均蓄积在骨骼中，半衰期长达5~20年^[3]，与骨骼发育畸形、骨质疏松、骨关节炎等密切相关^[4]。研究表明骨代谢就是成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的过程^[5]。Wingless protein(Wnt)信号通路是目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的新热点，Wnt/β-catenin信号通路在骨重建过程中起重要作用，与成骨细胞分化、增殖和骨形成密切相关，并通过不同途径影响破骨细胞及骨细胞功能^[6]；Wnt2属于分泌型蛋白家族成员，它通过自分泌或旁分泌作用，与位于细胞膜上的受体蛋白相结合^[7]，Wnt蛋白在成骨细胞中可通过经典信号通路调节成骨细胞的增殖和分化^[8]，参与骨发生过程的调节。转录因子1(transcription factor 1, Tcf-1) 是Wnt信号通路核内转录因子，在Wnt信号调控转录过程中起着分子开关作用，它与β-catenin结合后在核内共同调控靶基因，调节成骨细胞的活性和功能^[9]。过氧化物酶体增长因子活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ)是细胞核受体PPAR家族成员中之一，是重要的成脂分化转录因子，可调节骨髓间充质干细胞直接抑制前成骨细胞分化基因还可抑制Wnt信号通路，在机体生长发育及代谢方面有着十分重要的作用^[10]。β-catenin是一种胞质内的糖蛋白, 作为Wnt经典信号通路的起始蛋白和关键分子，直接参与调节成骨细胞形成和骨骼发育^[11]。目前铅对骨代谢的影响主要着重于研究通过影响维生素D，钙磷代谢而导致的骨发育异常、骨钙化障碍^[12]，对于Wnt信号通路中Wnt2、Tcf-1、PPAR-γ基因研究较少。因此，本研究通过观察染铅大鼠骨骼中铅、钙元素和骨组织形态及骨骼中PPAR-γ、Wnt2、Tcf-1和β-catenin的基因表达变化，旨在探讨铅对骨代谢的影响及其机制，为预防和改善铅中毒提供科学依据。结果报告如下。

21日龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限责任公司，生产许可证号码为：SCXK(京)2012-0001。自然昼夜，节律光照，温度(20±5)℃，相对湿度为40%~60%。基础饲料喂养，自由饮食、饮水。

Trizol(美国Invitrogen公司)，SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒和DNA Marker(大连宝生物公司)，醋酸铅(天津金汇太亚化学试剂有限公司)。Optima5300DV型ICP发射光谱仪(美国PE公司)，BX 51型生物显微镜(日本Olympus公司)，RM2265型切片机(德国LEICA公司)，HY-BM1160生物组织包埋机(金华惠友仪器生物有限公司)，Mx3000P荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)，Eppendorf AG核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司)，DYY-Ⅲ7B型电泳仪(北京市六一仪器厂)，BIO-RAD凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

大鼠随机分为4组：对照组、低、中、高剂量铅组，每组10只；对照组大鼠饮去离子水；低、中、高剂量铅组大鼠饮水中分别含有0.1%、0.2%、0.3%醋酸铅；饲养60 d后，过夜禁食12 h，称重后，用乙醚将大鼠麻醉处死，取后肢股骨，剔净周围肌肉组织，一部分经固定、脱水、包埋、切片、苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，光镜观察组织形态。另一部分组织迅速存于液氮中，然后在-80 ℃冰箱中保存，待用。

取股骨，加入8 mL硝酸和2 mL高氯酸(高氯酸：硝酸=1:4，V:V)静置过夜后于电炉上进行湿法消化，同时作对照管；消化至白色颗粒后用双蒸水定容至25 mL，用电感耦合等离子发射光谱仪测定骨组织中Pb、Ca含量。

采用荧光定量reverse transcriptase-PCR(RT-PCR)法，按Trizol试剂盒方法提取股骨组织中总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪对RNA进行检测。

应用Primer 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成，β-actin上游引物：5′-TACCCAGGCATTGCTGACAG-3′，下游：5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′，片段长度104 bp；PPAR-γ上游引物：5′-AGGAGCAGAGCAAAGAGGTG-3′，下游：5′-CACAGCAAACTCAAACTTAGGC-3′，片段长度107 bp；Wnt2上游引物：5′-CAACTTGACTTCCCGAGGCA-3′，下游：5′-GTAGGAGTTGTCCAGTCGGC-3′，片段长度171 bp；Tcf-1上游引物：5′-GGCTTACGAGAGGCAGAAGA-3′，下游：5′-TTACTG GGAGAGAGGGTGGTT-3′，片段长度198 bp；β-catenin上游引物：5′-ACACAACCTTTCCCACCATC-3′，下游：5′-GCTTTCCTGATTGCCGTAAG-3′，片段长度154 bp。

反应体系为10.0 μL：SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ(2×)5.0 μL，forward primer(10 μmol/L)1.0 μL，reverse primer(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 1.0 μL；dH2O(灭菌双蒸水)2.0 μL；反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，50个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95℃ 15 s；反应结束后，计算threshold cycle(Ct)值；然后取样品cDNA 1 μL为模板，按2倍浓度梯度稀释，进行荧光定量PCR反应。结果用MXPro-MX3000P软件(Stratagene公司)自动进行数据分析，绘制标准曲线。以β-actin为看家基因，计算待测基因相对表达量。

计量数据以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较进行方差齐性检验后选用单因素方差分析，再用最小显著差法进行均数间的两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

图 1

图 1 染铅对大鼠体重影响

结果显示，低、中、高剂量铅组大鼠体重分别在染铅第35、25、10 d明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 1

表 1 染铅对大鼠骨骼中Pb与Ca含量影响(mg/g，x±s，n=10) 组别(%) Pb Ca 对照组 0.003 3±0.000 6 23.712 0±0.879 3 染铅组 0.1 0.221 5±0.033 0a 21.719 4±1.120 8a 0.2 0.335 3±0.040 7a 21.559 5±1.094 0a 0.3 0.399 2±0.030 9a 21.421 7±0.700 2a 注:与对照组比较，a P＜0.01。

表 1 染铅对大鼠骨骼中Pb与Ca含量影响(mg/g，x±s，n=10)

与对照组比较，各剂量染铅组大鼠骨骼中铅含量均明显升高，而骨骼中钙含量均明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

图 2

注：A：对照组；B、C、D：低、中、高剂量铅组。 图 2 染铅对大鼠骨组织形态影响(HE，×200)

对照组大鼠股骨骨小梁丰富、结构相对紧密、饱满，钙盐沉着均匀(图 1A)；与对照组比较，低、中剂量铅组大鼠骨小梁相对变薄、变细(图 1B、C)；高剂量铅组大鼠股骨骨小梁稀疏、变细、变薄或断裂，骨髓腔相对扩大(图 1D)。

表 2

表 2 染铅对大鼠骨骼中Wnt通路因子mRNA表达影响(x±s，n=10) 组别(%) PPAR-γ Wnt2 Tcf-1 β-catenin 对照组 1.000 0±0.018 0 1.000 0±0.034 1 1.000 0±0.073 7 1.000 0±0.035 5 染铅组 0.1 0.983 2±0.009 2 0.998 9±0.022 9 0.995 6±0.076 2 0.995 9±0.035 4 0.2 0.910 9±0.026 5 0.869 4±0.049 6 0.915 2±0.069 5 0.916 6±0.012 1b 0.3 0.821 3±0.020 2b 0.852 6±0.030 8b 0.874 3±0.077 2a 0.874 5±0.055 3b 注：与对照组比较，a P＜0.05, b P＜0.01。

表 2 染铅对大鼠骨骼中Wnt通路因子mRNA表达影响(x±s，n=10)

与对照组比较，高剂量铅组大鼠骨骼中PPAR-γ、Wnt2、Tcf-1和β-catenin mRNA表达量均下降，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；与对照组比较，中剂量铅组大鼠骨骼中β-catenin mRNA表达量下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。

研究表明染铅可改变成骨细胞的形态、增殖速率和生物学标志物等，破坏成骨细胞活性，甚至导致成骨细胞的凋亡；当铅达到一定浓度时，也可改变成骨细胞的增殖功能^[13]。当铅在体内蓄积剂量超过一定负荷时人体的自我调节能力被破坏^[14]，可引起包括钙在内的许多微量元素功能稳态的异常，从而导致多种代谢紊乱。本研究结果表明染铅组大鼠骨骼中Pb含量明显高于对照组，而Ca含量则明显低于对照组。可能与Pb、Ca均为二价离子，具有相似的生理生化性质，Pb与Ca在小肠上皮吸收的过程中，相互间存在竞争拮抗作用，且铅对骨组织高度亲和，导致骨骼中Ca水平变化有关。与已有研究结果一致^[15]。

胡雪琴等^[16]通过动物模型研究发现，铅暴露可导致大鼠股骨骨质密度稀疏，骨小梁数目锐减，使软骨的成骨作用受到干扰。本研究结果表明染铅组大鼠股骨中骨小梁网状结构被破坏，骨髓腔不明显。提示，由于铅与钙的拮抗作用，铅的存在破坏了骨组织中钙磷平衡，磷酸铅代替了钙盐的沉积，导致骨组织的结构受到损伤^[17-18]。

Bodine等^[19]研究表明，Wnt信号通路是参与调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制成骨细胞的程序性死亡的经典通路。当Wnt与Frizzled蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白偶联受体5/6(lipoprotein receptor related protein 5/6, LRP5/6) 结合时，β-catenin次磷酸化作用，通路被激活，利于成骨前体细胞向成骨细胞转化，成骨细胞增殖及分化功能加强，骨合成代谢活跃。PPAR-γ激活后参与调节细胞的增殖、分化及凋亡。本研究结果显示，高剂量染铅可降低大鼠骨骼中PPAR-γ、Wnt2、β-catenin及Tcf-1基因mRNA表达。提示，铅能够通过Wnt/β-catenin信号通路影响下游PPAR-γ及Tcf-1基因表达，抑制成骨细胞增殖、分化及破骨细胞功能，进而影响骨形成及骨的重建。

综上所述，染铅可使骨骼中Pb水平升高，Ca含量下降；导致骨组织形态结构损伤，其机制可能与下调Wnt通路中PPAR-γ、Wnt2、β-catenin及Tcf-1基因表达，影响骨细胞增殖和分化有关。