中国公共卫生  2017, Vol. 33 Issue (3): 478-481   PDF    
引用本文
肖云军, 黄海雄, 吴小敏, 张锦周, 黄薇, 黄海燕, 凌文华. 甜菜碱对高SAH诱导动脉粥样硬化保护作用[J]. 中国公共卫生, 2017, 33(3): 478-481.
XIAO Yun-jun, HUANG Hai-xiong, WU Xiao-min, et al. Protective effect of beataine against high S-adenoslhomocyteine-induced atherosclearosis[J]. Chinese Journal of Public Health, 2017, 33(3): 478-481.
甜菜碱对高SAH诱导动脉粥样硬化保护作用
肖云军1, 黄海雄1, 吴小敏1, 张锦周1, 黄薇1, 黄海燕1, 凌文华2     
1. 深圳市疾病预防控制中心, 广东 518055;
2. 中山大学公共卫生学院
收稿日期: 2016-02-17; 数字出版日期: 2016-05-19 10:53.
基金项目: 国家自然科学基金（81402672）
作者简介: 肖云军 (1984-), 男, 安徽人, 副主任医师, 博士, 主要从事营养与疾病研究和食品卫生工作。
摘要： 目的 探讨甜菜碱补充对高S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）诱导的动脉粥样硬化（AS）的影响。 方法 采用apoE基因敲除（apoE-/-）小鼠制备AS模型，饮食添加高蛋氨酸和SAH水解酶抑制剂建立高SAH模型，在SAH模型基础上饮食添加不同剂量甜菜碱干预，观察小鼠血脂水平、血浆SAH、S-腺苷蛋氨酸（SAM）、同型半胱氨酸（Hcy）浓度以及SAM/SAH比值变化，采用油红O染色观察apoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块情况。 结果 与对照组比较，高SAH模型组小鼠血浆SAH水平[（78.61±4.62）nmol/L]升高，SAM水平[（40.17±3.02）nmol/L]及SAM/SAH比值（0.65±0.11）降低，Hcy水平[（6.97±0.51）μmol/L]无明显变化，AS斑块绝对面积[（52.65±8.40）mm2]和相对面积（25.47±5.23）%均增加；与高SAH模型组比较，高剂量甜菜碱组小鼠血浆SAH水平[（30.18±3.85）nmol/L]、Hcy水平[（4.91±0.30）μmol/L]降低，SAM水平[（78.14±3.99）nmol/L]及SAM/SAH比值（2.78±0.34）升高，AS斑块绝对和相对面积[（28.75±7.24）mm2、（13.89±3.96）%]下降；呈剂量-效应关系。 结论 甜菜碱干预可降低apoE-/-小鼠血浆高SAH水平，对高SAH诱导的动脉粥样硬化具有缓解作用。
关键词： 甜菜碱     S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）     动脉粥样硬化（AS）     apoE-/-小鼠    
Protective effect of beataine against high S-adenoslhomocyteine-induced atherosclearosis
XIAO Yun-jun, HUANG Hai-xiong, WU Xiao-min, et al     
Department of Nutrition and Food Hygiene, Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen, Guangdong Province 518055, China
Abstract: Objective To explore the effect of betaine supplementation against high S-adenoslhomocysteine (SAH)-induced atherosclerosis (AS). Methods Dietary supplementation of high methionine and SAH hydrolase inhibitor was used to establish a model of high SAH-induced AS in apoE-deficient (apoE-/-) mice.The mice with high plasma SAH level were treated with betaine at three different doses.After 8 and 16 weeks' betaine treatment, blood samples of the mice were collected to measure serum lipids levels, plasma SAH, S-adenoslmethionine (SAM), and homocysteine (Hcy) concentrations.The hearts of apoE-/- mice were examined to assess the AS plaque area by staining with oil red O. Results Compared with the control group, the mice of high SAH group showed increased plasma SAH concentration (78.61±4.62 nmol/L), decreased SAM concentration (40.17±3.02 nmol/L), and decreased SAM/SAH ratio (0.65±0.11);there was no significant change in Hcy concentration (6.97±0.51μmol/L), while there were increases in absolute plaque area (52.65±8.40 mm2) and relative AS plaque area (25.47±5.23%) in the mice of high SAH group.Compared with high SAH group, the mice with high-dose betaine supplementation had significantly decreased plasma SAH (30.18±3.85 nmol/L) and Hcy (4.91±0.30μmol/L), increased SAM (78.14±3.99 nmol/L) and SAM/SAH ratio (2.78±0.34), and reduced high SAH-induced absolute AS plaque area (28.75±7.24) mm2 and relative AS plaque area (13.89±3.96%), in a dose-response dependent manner. Conclusion Betaine supplementation could signifi-cantly decrease high plasma SAH level and reduce high SAH-induced AS plaque area in apoE-/- mice.
Key words: betaine     S-adenoslhomocysteine     atherosclerosis     apoE-/-mice    

动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是一种多因素、多阶段的慢性退行性病变，是心脑血管疾病发病的主要病理基础。同型半胱氨酸 (homocysteine, Hcy) 是人体必需氨基酸蛋氨酸代谢的中间产物。血浆Hcy浓度升高被认为是心脑血管疾病发病的一个独立危险因素[1]。动物实验表明严重的高同型半胱氨酸血症 (hyperhomocysteinemia, HHcy) 加剧AS的发生[2]。S-腺苷同型半胱氨酸 (S-adenoslhomocysteine, SAH) 是Hcy的代谢前体，经SAH水解酶的作用水解脱去腺苷生成Hcy，SAH是由S-腺苷蛋氨酸 (S-adenoslmethionine, SAM) 作为甲基供体参与机体DNA、组蛋白的甲基化而产生。近年研究表明血浆SAH水平是预测心血管疾病的敏感标志物[3]，且血浆SAH水平升高独立于Hcy水平预测冠心病患者心血管事件的发生风险[4]。采用SAH水解酶抑制剂腺苷二醛在apoE基因缺陷 (apolipoprotein E-deficient, apoE-/-) 小鼠中可成功建立高血浆SAH模型，且发现SAH水平的增高可促进apoE-/-小鼠AS的发生[5]。甜菜碱是一种从天然植物的根、茎、叶及果实中提取的碱性物质，具有抗肿瘤，降低血压，降血脂，防治肝脏疾病等生物功效。甜菜碱的有效成份为三甲基甘氨酸，具有甲基供体功能，参与Hcy作为底物的蛋氨酸再生与循环。研究表明甜菜碱可有效地抑制蛋氨酸过量导致的HHcy，缓解apoE-/-小鼠AS斑块的严重性[6-7]。本研究以apoE-/-小鼠为实验动物，在饲料中添加蛋氨酸和腺苷二醛建立高SAH模型，同时给予甜菜碱进行干预，探讨补充甜菜碱对高SAH诱导AS的影响，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

蛋氨酸、重酒石酸胆碱、酪蛋白、腺苷二醛、甜菜碱及油红O (美国Sigma公司)；维生素混合物 (vitamin mix, AIN-93-VX)、矿物质混合物 (mineral mix, AIN-93-MX)(美国Harlan公司)；冰冻切片包埋剂 (美国Sakura公司)；高效液相色谱仪 (high performance liquid chromatography, HPLC)(日本岛津公司)；高效液相色谱串联质谱仪 (high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)(美国Agilent公司)；恒温冷冻切片机 (德国Leisa公司)。

1.2 实验动物分组与处理

C57BL/6纯系apoE-/-小鼠，购自广东省动物实验中心，许可证号：SCXK (粤)2013-0002。将40只断乳后的apoE-/-小鼠，放在层流架中喂饲普通小鼠饲料到达8周鼠龄后按照体重随机分成5组，每组8只：对照组 (普通饲料)，高SAH组 (含蛋氨酸10 g/kg+腺苷二醛0.04 g/kg饲料)，甜菜碱低、中、高剂量组 (高SAH饲料+1%、2%、4%甜菜碱)；将各组小鼠放在层流架中分笼喂养，自由饮水摄食，动物房室内温度为 (24±2)℃，照明时间为每天08:00—20:00；每周称体重1次，记录各组动物的摄食量。连续喂养8周，干预结束后小鼠经眼眶静脉采血后颈椎脱臼处死，采集新鲜血液收集于依地酸钙钠抗凝试管中，30 min内3 000 r/min 4 ℃离心15 min，分离血浆分装保存于-80 ℃冰箱待测；取出小鼠心、肝、脾、肾、肺用于脏器系数评价并保存-80 ℃冰箱；取小鼠新鲜心脏，冷生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干多余液体，10%福尔马林中保存，小鼠主动脉窦用于AS斑块面积分析。

1.3 指标与方法 1.3.1 血浆生化指标检测

血清总胆固醇 (cholesterol, TC)、甘油三酯 (triglyceride, TG) 水平的测定分别采用胆固醇氧化酶法及磷酸甘油氧化酶法，最后通过分光光度计在500 nm处测得吸光度 (A) 值。高密度脂蛋白胆固醇 (high density lipoprotein cholesterol, HDL-C) 和低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol, LDL-C) 测定所用试剂和方法均按照南京建成试剂盒说明书进行操作；血浆Hcy水平采用HPLC检测，参照Ubbink等[8]方法。血浆SAH和SAM浓度检测参照Gellekink等[9]方法，采用HPLC-MS/MS进行测定。

1.3.2 AS斑块分析

采用冰冻切片包埋剂包埋心脏组织置-80 ℃冰箱中冷冻，恒温切片机制作10 μm厚切片。主动脉窦远端辨认是以心脏和主动脉连接处的三尖瓣为依据。取小鼠主动脉窦冰冻切片，于37 ℃温箱中烘干，并恢复至室温进行油红O染色，中性脂肪呈红色，胞核呈蓝色。采用Image Pro Plus图像分析软件分析各组小鼠主动脉窦AS斑块面积绝对值及主动脉窦的管腔面积，以小鼠AS斑块面积/管腔面积比值的平均值表示各组小鼠AS斑块相对面积的大小[5]。

1.4 统计分析

数据以x±s表示，应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，两组均数之间比较采用t检验或Wilcoxon检验，多组间的比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 甜菜碱对apoE-/-小鼠一般状况影响 (表 1)
表 1 甜菜碱对apoE-/-小鼠一般状况影响 (x±s, n=8)

与对照组比较，高SAH模型组、甜菜碱高、中、低剂量组小鼠体重增长量、饮食摄入量和肝脏系数无明显变化。

2.2 甜菜碱对apoE-/-小鼠血浆血脂水平影响 (表 2)
表 2 甜菜碱对apoE-/-小鼠血浆血脂水平影响 (mmol/L, (x±s, n=8)

与对照组比较，甜菜碱高剂量组小鼠TG水平降低、高SAH模型组HDL-C水平降低，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；与高SAH模型组比较，甜菜碱高剂量组LDL-C水平降低，差异有统计学意义 (P < 0.05)。

2.3 甜菜碱对apoE-/-小鼠血浆蛋氨酸代谢物水平影响 (表 3)
表 3 甜菜碱对apoE-/-小鼠血浆蛋氨酸代谢物水平影响 (x±s, n=8)

与对照组比较，高SAH模型组apoE-/-小鼠血浆SAH浓度升高，SAM浓度和SAM/SAH比值降低，差异均具有统计学意义 (P < 0.05)；与高SAH模型组比较，甜菜碱中、高剂量组SAH浓度降低，SAM浓度和SAM/SAH比值升高，高剂量甜菜碱组小鼠血浆Hcy浓度明显降低，差异有统计学意义 (P < 0.05)；与甜菜碱低剂量组比较，甜菜碱高剂量组小鼠血浆SAH浓度降低，SAM浓度以及SAM/SAH比值升高，差异均具有统计学意义 (P < 0.05)。

2.4 甜菜碱对apoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块影响 (表 4)
表 4 甜菜碱对apoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块的影响 (x±s, n=8)

与对照组比较，高SAH模型组apoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块绝对面积和相对面积均增加，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；与高SAH模型组比较，甜菜碱中、高剂量组apoE-/-小鼠主动脉窦AS斑块绝对面积和相对面积均降低，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；呈剂量-效应关系 (P < 0.05)。

3 讨论

ApoE-/-小鼠采用同源重组的基因打靶技术使apoE基因失活，动物可在普通饲料喂养下产生严重的高胆固醇血症，并自发形成AS斑块。因为apoE-/-小鼠形成的AS斑块分布与人类AS斑块的分布极为相似，给研究各种相关疾病提供了广阔平台，是目前在AS研究领域中应用最为广泛的理想动物模型。本研究以apoE-/-小鼠作为AS的疾病模型，采用SAH水解酶抑制剂阻断SAH水解成Hcy，同时添加过量蛋氨酸导致体内SAH累积产生更高的血浆SAH浓度，结果显示，与对照组比较，高SAH模型组小鼠血浆SAH浓度升高约3倍。提示，高血浆SAH的模型建立成功，且高SAH模型组小鼠AS斑块较为严重，与已有研究结果一致[5, 10]。本研究结果还显示，甜菜碱组小鼠血浆SAH水平明显降低、且高SAH诱导的小鼠AS得到缓解。

在蛋氨酸代谢循环中，SAH是Hcy的前体，升高血浆Hcy可逆地诱导血浆SAH的升高，因此，Hcy对AS的致病作用可能部分通过SAH介导。研究表明在HHcy小鼠中同时升高的SAH水平与血管功能受损存在相关，并且这种相关性在正常血浆Hcy水平的小鼠中仍然存在，独立于血浆Hcy的水平[11]。另一项研究表明血浆SAH水平与AS严重性存在正向关联且独立于Hcy水平[12]。血浆Hcy水平受多因素影响，如蛋氨酸代谢中相关代谢酶基因突变，营养缺乏 (维生素B12、B6和叶酸) 均可造成HHcy。尽管严重HHcy动物模型能引起AS病变，但接近正常生理水平轻度升高的HHcy并不能增加AS的严重性。近年来大规模的临床干预研究表明尽管B族维生素的补充能够有效地降低血浆Hcy水平，但却不能减少心血管疾病的风险[13-14]。进一步对Hcy和心血管疾病之间的因果关系提出了质疑。由于SAH水平与Hcy水平在心血管疾病患者中往往是平行升高的，因此，在HHcy中升高的SAH水平可能是心血管疾病的另一个真正危险因素。

影响Hcy代谢的另一个因素是甜菜碱，膳食中甜菜碱摄入量已成为衡量血液中Hcy水平高低的决定因素之一[15-16]。甜菜碱影响Hcy代谢主要通过刺激甜菜碱Hcy甲基转移酶途径的再甲基化，促进SAM浓度的升高，激活胱硫醚-β-合成酶促进胱硫醚合成，从而降低Hcy水平。本研究结果表明甜菜碱干预可有效地降低小鼠血浆SAH水平，升高SAM水平，增加SAM/SAH比值，降低Hcy水平。提示，甜菜碱能够缓解高SAH诱导的AS病变，其机制可能与甜菜碱通过动态调节Hcy代谢从而降低SAH水平有关。

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