肾小球肾炎属于一种终身性疾病，它以蛋白尿、高血压、血尿和水肿为主要临床表现，给身体健康带来严重威胁。有流行病学调查显示，慢性肾脏病在发达国家的发病率约为6.5%~16.2%，其中慢性肾小球肾炎在终末期慢性肾病患者中约占19%，已成为终末期肾衰竭透析患者最为常见的原发病类型之一^[1]。当前临床治疗针对此类疾病患者常给予利尿消肿、降压以及并发症对症支持等基础治疗，但是由于缺乏高效特异性方案，多数病例效果不甚理想^[2]。因此探究该疾病发生机制，寻求更为安全高效的治疗方案对改善临床疗效和预后至关重要。近年来，中医药在肾小球肾炎患者中逐渐凸显优势，辨证论治不仅可改善疗效，还具有较高的安全性^[3]。为探讨中医药对肾小球肾炎疗效和作用机制，本研究通过建立肾小球肾炎大鼠模型，给予补肾活血中药和西药盐酸贝那普利进行干预，观察补肾活血中药对肾小球肾炎大鼠肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β, TGF-β_1) 及结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) 表达的影响。

6月龄specific pathogen free (SPF) 级Wister健康雄性大鼠40只，体重 (150±10) g，购自中国医学科学院放射医学研究所动物中心，许可证号：SYXK (津)2005-0001。饲养条件：温度24℃、湿度40%-50%，采用排气扇、空调维持气流，光照节律为明/暗12h交替。

完全弗氏佐剂 (生产批号：SLBC5083) 和不完全弗氏佐剂 (生产批号：SLBB9817) 均购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司；葡萄球菌肠毒素B (生产批号：15081721B) 购自北京博迈世纪生物技术有限公司；盐酸贝那普利 (批准文号：国药准字H20000292) 购自北京华诺制药有限公司。TL-18M型高速离心机购自上海市离心机械有限公司；7600-020型全自动生化分析仪购自日本日立公司，试剂盒购自深圳晶美生物科技有限公司；DSX500光学显微镜购自日本Olympus公司。

选取30只大鼠建立实验动物模型，参照文献[4]建立肾小球肾炎大鼠模型，并于第1 d将20 mg牛血清白蛋白溶于2 mL纯净水中灌胃，隔日1次，持续, 16周；第1 d需另给予完全弗氏佐剂，剂量为0.2 mL，给药方法为分点皮下注射；第8 d给予不完全弗氏佐剂，剂量和给药方法参照完全弗氏佐剂；第8d和第15 d给予葡萄球菌肠毒素B，剂量为0.4 mg/kg，给药方法为尾静脉注射；于注射1 d后抽取静脉血测定尿蛋白 (+++) 判定肾炎模型建立情况，30只大鼠均造模成功，并随机分为模型组、中药组和盐酸贝那普利组3组，每组10只，另选取未建模的10只同批次大鼠作为对照组。中药组给予补肾活血中药煎剂 (购自天津中医药大学第一附属医院中药房，中药饮片质检及制备均由天津中医药大学药厂协助完成) 灌胃，中药煎剂药材组方：大黄、虫草各20 g，丹参、黄芪各15 g，菌陈10 g，加水浓煎，提取生药浓度为2.5 g/mL，给予灌胃干预，参照马氏定理^[5]确定用药剂量为17.01 g/kg；盐酸贝那普利组给予西药盐酸贝那普利灌胃处理，剂量同中药组；模型组和对照组均给予等量无菌生理盐水灌胃。所有大鼠干预时间均为8周。干预过程中若有大鼠死亡，则剔除本研究。

所有大鼠均于停药后禁食1 d，将其置于代谢笼内留取24 h尿液行24 h尿蛋白检测，同时取腹主动脉血离心分离处理后，分别采用二乙酰-肟法和酶联速率法检测血尿素氮和血肌酐水平。

采用脊椎脱臼法处死大鼠后，迅速取出肾脏组织，置于冷生理盐水中清洗2次，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常规制备石蜡切片，然后脱蜡至水，行苏木素-伊红 (hematoxylineosin staining，HE) 染色，光学显微镜下拍摄病理照片，观察病理变化。

脊椎脱臼法处死大鼠，迅速取出肾脏组织，将肾包膜剥离后取4%多聚甲醛溶液用于肾组织固定，应用免疫荧光化学法对肾脏组织TGF-β_1和CTGF蛋白相对含量进行测定，石蜡包埋后切片，层厚设置为3μm，将一抗、二抗滴入采用磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline，PBS) 洗片，并将其置于37℃条件下孵育30 min，采用甘油封片；在400倍光学显微镜下随机选取10个非重复视野，利用计算机软件测定并记录TGF-β_1和CTGF免疫荧光相对含量。

处理数据，均用 (%) 描述计数资料，多样本比较采用秩和检验；计量资料以x±s表示，应用SPSS 16.0软件进行统计分析，多组建比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表 1

表 1 不同组别大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平比较 组别 n 24h尿蛋白 (mg/24h) 血尿素氮 (mmol/L) 血肌酐 (μmol/L) 对照组 10 10.38±2.17 4.01±0.37 2.55±1.01 模型组a 9 96.58±5.32b 10.82±0.59b 33.54±3.32b 盐酸贝那普利组 10 50.30±5.08bc 6.03±0.52bc 17.96±2.03bc 中药组 10 49.76±4.82bc 5.98±0.57bc 17.89±2.17bc 注：a模型组在干预过程中有1只大鼠死亡。与对照组比较，b P＜0.05；与模型组比较，c P＜0.05。

表 1 不同组别大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平比较

与对照组比较，模型组、中药组和盐酸贝那普利组24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平均高于对照组 (均P＜0.05)；与模型组比较，中药组和盐酸贝那普利组24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平均低于模型组 (均P＜0.05)；中药组与盐酸贝那普利组24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平差异均无统计学意义 (均P＞0.05)。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C：盐酸贝那普利组；D：中药组。 图 1 肾组织病理学变化 (HE，×200)

对照组大鼠肾脏组织结构清晰，肾小球无肥大，且未见系膜增生 (图 1A)；模型组大鼠肾脏组织结构模糊，肾小球肥大明显严重肥大，且系膜增生严重 (图 1B)；盐酸贝那普利组大鼠肾脏组织肾小球部分肥大，肠系膜增生，但均较模型组减轻 (图 1C)；中药组大鼠肾脏组织肾小球部分肥大，肠系膜增生，但均较模型组明显减轻 (图 1D)。

表 2

表 2 不同组别大鼠肾脏组织TGF-β_1和CTGF免疫荧光相对含量比较 组别 n TGF-β_1免疫荧光相对含量 CTGF免疫荧光相对含量 对照组 10 0.035±0.007 0.017±0.004 模型组a 9 5.296±0.124b 5.347±1.285b 盐酸贝那普利组 10 1.697±0.468bc 1.078±0.327bc 中药组 10 0.568±0.156bcd 1.285±0.466bc 注：a模型组在干预过程中有1只大鼠死亡; 与对照组比较，b P＜0.05；与模型组比较，c P＜0.05；与盐酸贝那普利组比较，d P＜0.05。

表 2 不同组别大鼠肾脏组织TGF-β_1和CTGF免疫荧光相对含量比较

与对照组比较，模型组、中药组和盐酸贝那普利组TGF-β_1和CTGF免疫荧光相对含量均高于对照组 (均P＜0.05)；与模型组比较，中药组和盐酸贝纳普利组TGF-β_1和CTGF免疫荧光相对含量均低于模型组 (均P＜0.05)；与盐酸贝纳普利组比较，中药组TGF-β_1免疫荧光相对含量低于盐酸贝那普利组 (t=7.237，P＜0.001)，CTGF免疫荧光相对含量与盐酸贝纳普利组差异无统计学意义 (P＞0.05)。

研究表明，肾小球肾炎发病机制可归结为以下几个方面：(1) 抗原抗体复合物引发肾小球损伤，主要包括抗体和细胞免疫反应2种介导物质；(2) 肾脏浸润细胞和固有细胞内氧自由基产生过多，但是清除过程却出现障碍，导致肾小球不可逆损伤，而具有诱发原因尚未可知；(3) 凝血机制紊乱和血液流变学异常也是导致肾小球肾炎发生和加重的重要原因^[6]。在肾小球肾炎患者中，24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平较正常健康人群明显升高，其具体变化机制为：病变影响肾小球滤过以及肾小管重吸收，导致24 h尿蛋白水平异常升高。血尿素氮和血肌酐是反应机体肾脏功能最为重要的临床指标，肾脏损害越严重，肾功能越差，两者水平越高，主要与肾脏病变影响肌酸酐正常排泄有关。因此临床上应当以降低24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平为重要治疗原则。

近年来，国外相关研究资料表明，TGF-β_1和CTGF表达异常对肾小球肾炎发病具有严重影响^[7]。TGF-β_1可对细胞外基质中胶原蛋白和纤维蛋白等主要成分产生降解作用，从而造成肾小球损伤^[8]；此外，该因子还可降低基质金属蛋白酶活性，并通过增加基质金属蛋白酶抑制剂的活性间接促进细胞外基质中胶原蛋白和纤维蛋白降解进程^[9]。Grabias等^[10]研究表明，TGF-β_1表达和CTGF表达存在一定相关性，而后者作为一种重要的致纤维化因子，在加重肾脏组织损伤过程中作用显著。正常生理状态下，机体内仅有肾小球系膜细胞和肝星状细胞合成并分泌少量的CTGF，但是该因子是TGF-β_1的一种下游细胞效应因子，受后者调控^[11]，因此TGF-β_1表达异常会引发CTGF的异常表达，两者在肾小球肾炎发生过程中起重要协同作用。目前有研究认为，CTGF诱导肾小球损伤的机制主要有：促使mesangial cell (MC) 增生^[12]、诱导extracellular matrix (ECM) 积聚和减少足细胞数量^[13]。由此可见，TGF-β_1和CTGF蛋白在肾小球肾炎形成和发展过程中起着重要作用。

补肾活血中药以大黄、虫草、丹参、黄芪、菌陈等中药材组方。大黄可清热泻火、凉血祛瘀^[14]，虫草可补肺益肾、健脾益气，丹参可活血镇痛、畅达经脉，黄芪可补气固表、利水消肿，菌陈可清热利湿、解毒镇痛，全方合用，共奏祛瘀解毒、补肾活血之效。现代药理研究证实，黄芪在肾小球肾炎大鼠中应用可显著调节T淋巴细胞亚群水平，并通过对核因子kB产生抑制作用减少TGF-β1表达^[15]。本研究结果中，中药组和盐酸贝那普利组24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐和CTGF免疫荧光相对含量均无明显差异，且与对照组水平更为接近，提示补肾活血中药可有效改善大鼠肾小球滤过率功能，其治疗肾小球肾炎中应用前景良好。另外还有研究认为，任何因素引起的肾脏疾病，其肾功能减退与小管间质的病理改变均存在密切关系，同时肾功能受损时还容易伴有肾脏结构损伤^[16]。本研究病理组织学检查结果显示，模型组大鼠病理学显示结构模糊，肾小球肥大明显严重肥大，且系膜增生严重，而经过药物干预后，肾小球、肾小管及系膜增生程度均较模型组明显减轻，其中中药组减轻更加明显。此结果进一步充分表明，补肾活血中药能够有效减轻肾小球肾炎大鼠肾脏组织纤维化病变，促使肾小球恢复。此外，中药组TGF-β_1免疫荧光相对含量明显低于其他3组，且CTGF免疫荧光相对含量明显低于模型组，提示补肾活血中药可能通过下调TGF-β_1和CTGF蛋白表达发挥效用，但具体机制有待进一步研究。