胶质瘤是中枢神经系统中恶性程度较高及最为常见的肿瘤。其中，以胶质母细胞瘤 (glioblastoma, GBM) 最为高发。患者在诊断后的生存时间通常＜14.6个月，仅仅比25年前的生存期增加了2.5个月^[1]。目前，最为有效的GBM治疗方法仅能短暂的增加患者的生存时间，且仍存在着易复发和转移的特性。大多数GBM均存在过氧化物还原酶4(peroxiredeoxin 4，PRDX4) 过度高表达，敲除PRDX4能够增加细胞内活性氧 (ROS) 含量，进而导致GBM细胞的凋亡。研究表明荜茇酰胺可选择性的增加ROS水平对多种肿瘤具有杀伤作用，如乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤和GBM等^[2]。荜茇酰胺是由植物荜茇中提取的天然生物碱，荜茇酰胺在杀伤肿瘤细胞同时，对正常细胞无明显影响，可减少化疗对机体的影响^[3-4]。研究发现，荜茇酰胺处理后的肿瘤细胞中ROS水平成倍增长，而正常细胞内ROS水平则无明显变化，表明荜茇酰胺具有肿瘤细胞靶向治疗特性。研究表明，荜茇酰胺的抗肿瘤作用与PRDX 1等多种抗氧化蛋白密切相关^[5]，荜茇酰胺在全养分培养条件下能够选择性的介导GBM凋亡^[6]。但荜茇酰胺抗肿瘤作用机制仍不十分清楚^[7]。本研究采用2种人胶质瘤细胞系U87、U251，探讨荜茇酰胺对胶质瘤细胞增殖抑制作用及机制，结果报告如下。

人胶质瘤细胞系U87、U251(上海细胞库)，DMEM (美国Thermo公司)；荜茇酰胺 (华北制药股份有限公司)，噻唑蓝 (MTT)、2-cys-peroxiredoxin活性检测试剂盒 (上海生工生物技术公司)，ROS检测试剂盒 (南京建成公司)，annexin V染色凋亡检测试剂盒 (美国Thermo Fisheries公司)，Trizol (美国sigma公司)，PCR (RT-PCR) 试剂盒 (日本Takara公司)。分光光度计 (美国Cole-Parmer公司)，RT-PCR仪 (美国Bio-Rad公司)。

将5.0×10³个细胞接种于96孔板或3.0×10⁴个细胞种于24孔板培养24 h；(1) 细胞增殖能力检测：实验分别设U87、U251细胞对照组、荜茇酰胺1、10 μmmol/L组，处理细胞24 h；(2) 细胞凋亡、ROS及相关因子检测：实验分别设U87、U251细胞对照组、荜茇酰胺10 μmmol/L组，处理细胞24 h，收集细胞用于各指标检测。每组设3个复孔。

采用MTT法，各组细胞经荜茇酰胺处理后，弃去培养液，加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，采用分光光度计测定450 nm处吸光度 (absorbancy, A) 值。

培养细胞中加入10 μm DCFH-DA于培养基中，37 ℃孵育细胞30 min，胰酶消化，加入培养基终止消化，制成细胞悬液，1 000 g离心10 min收集细胞，用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤2次，离心收集细胞，500 nm激发光检测。

采用Annexin V染色法，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

采用RT-PCR法，RNA提取使用Trizol法，反转录成cDNA后作为模板，以β-actin为内参，β-actin、PRDX1-6引物序列见表 1。使用Takara公司qPCR试剂盒，Bio-Rad公司CFX，每组3个复孔。反应条件为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。由仪器配套专用软件进行结果分析。

表 1

表 1 PRDX1-6基因引物序列 基因名称 上游引物 下游引物 片段长度 (bp) β-Actin ATCTGGCACCACACCTCC AGGCAGGTCCAGCA 75 PRDX1 AATGCAAAAATTGGGTATCCTGC CGTGGGACACACAAAAGTAAAGT 83 PRDX2 GATGGTGCCTTCAAGGAAATCA CCGTGGGGCAAACAAAAGTG 78 PRDX3 GGTTGCTCGTCATGCAAGTG CCACAGTATGTCTGTCAAACAGG 95 PRDX4 TCCTGTTGCGGACCGAATC CCACCAGCGTAGAAGTGGC 79 PRDX5 GGCTGTTCTAAGACCCACCTG GGAGCCGAACCTTGCCTTC 82 PRDX6 CGCCAGAGTTTGCCAAGAG TCCGTGGGTGTTTCACCATTG 98

表 1 PRDX1-6基因引物序列

采用2-Cys-Peroxiredoxin试剂盒，收集细胞，取30 μg细胞裂解液或者3 μg重组人PRDX4蛋白与硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶以及还原型辅酶Ⅱ(NAPDH) 混合，加入10 mmol/L过氧化氢启动反应，使用Cole-Parmer分光光度计在630 nm波长下检测NADPH消耗量。

数据以x±s表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验和方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

表 2

表 2 荜茇酰胺对各种细胞增殖能力影响 (A, x±s，n=3) 组别 (μmol/L) U87 U251 正常神经元 对照组 1.6±0.15 1.52±0.21 1.31±0.18 荜茇酰胺1 1.5±0.18 1.33±0.14 1.29±0.12 10 0.45±0.23a 0.43±0.15a 1.33±0.15 注：与对照组比较，a P < 0.01。

表 2 荜茇酰胺对各种细胞增殖能力影响 (A, x±s，n=3)

与对照组比较，高剂量荜茇酰胺组胶质瘤细胞增殖能力明显下降，差异有统计学意义 (P < 0.01)；荜茇酰胺对正常神经元的增殖能力无明显影响。

结果显示，对照组U87、U251、正常神经元中ROS水平分别为 (102±12)%、(106±11)%、(99±14)%，10 μmol/L荜茇酰胺组U87、U251、正常神经元中ROS水平分别为 (156±17)%、(160±14)%、(105±9)%；与对照组比较，荜茇酰胺组U87、U251细胞中ROS含量明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.05)；而在正常神经元中ROS未见明显变化。对照组U87、U251、正常神经元凋亡率分别为7.62%、8.21%、7.93%，10 μmol/L荜茇酰胺组U87、U251、正常神经元凋亡率分别为19.4%、29.4%、8.24%；与对照组比较，荜茇酰胺组U87、U251细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.01)。

表 3

表 3 荜茇酰胺对胶质瘤细胞中PRDX4基因表达影响 (x±s，n=3) 基因 U87 U251 对照组 荜茇酰胺组 对照组 荜茇酰胺组 PRDX1 101±11 110±21 103±10 108±18 PRDX2 102±9 100±19 106±12 111±8 PRDX3 98±10 101±17 101±18 125±10 PRDX4 212±20 108±8a 230±15 102±11a PRDX5 103±14 113±12 109±8 115±11 PRDX6 105±13 117±12 110±9 109±7 注：与对照组比较，a P < 0.01。

表 3 荜茇酰胺对胶质瘤细胞中PRDX4基因表达影响 (x±s，n=3)

结果显示，与对照组比较，10 μmol/L荜茇酰胺组U87、U251细胞中PRDX4基因表达水平明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.01)。

结果表明，对照组U87、U251、正常神经元中PRDX4酶相对活性分别为 (100±12)%、(102±9)%、(101±17)%，10 μmol/L荜茇酰胺组U87、U251、正常神经元中PRDX4酶相对活性分别为 (49±6)%、(51±7)%、(63±11)%；与对照组比较，荜茇酰胺组U87、U251细胞中PRDX4酶相对活性受到明显抑制。

研究表明，PRDX4在胶质瘤中存在高表达现象，并且PRDX4敲除后能够明显增加细胞内ROS水平从而杀伤胶质瘤细胞^[8]。本研究结果显示，天然植物提取物荜茇酰胺能够特异性降低胶质瘤细胞中PRDX4活性，从而降低肿瘤细胞增殖能力。过量的ROS水平能够引起氧化应激、DNA损伤和基因组的不稳定。但近期研究表明，许多肿瘤中抗氧化应激蛋白的表达量均高于正常组织，这些在肿瘤组织中高表达的抗氧化应激蛋白减少了肿瘤细胞中ROS水平，进而降低内质网应激，使肿瘤细胞更加易于生存^[9-10]。因此，通过增加氧化应激来促进肿瘤细胞的凋亡，可能成为未来重要的抗肿瘤治疗手段。

本研究采用现阶段胶质瘤研究中最常用的细胞系U87、U251为研究对象，该胶质瘤细胞中ROS的调节基因表达水平远高于正常神经元。研究表明羟基还原酶1(CBR1)、谷氨酰胺转移酶1(glutathione S-transferase Z1, GSTZ1) 以及PRDX1等基因的敲除对荜茇酰胺介导的人胶质瘤细胞增殖能力的抑制无明显影响。提示，荜茇酰胺在胶质瘤细胞中存在其他作用靶点。本研究结果显示，荜茇酰胺组胶质瘤细胞中PRDX4表达升高，同时荜茇酰胺不影响正常神经元中PRDX4表达。提示，荜茇酰胺可选择性的抑制胶质瘤细胞生长和增殖，其机制可能与荜茇酰胺抑制胶质瘤细胞内PRDX4基因表达及酶活性，进而升高胶质瘤细胞中ROS水平，启动细胞氧化应激过程有关。