2017, Vol. 33
随着稀土元素 (rare earth element，REE) 广泛应用于不同行业，环境中的稀土元素不断增加，进入人体并在组织器官中积累。流行病学调查发现少年儿童对于稀土元素的神经毒性非常敏感[1]。镧是一种广泛使用的稀土元素，研究表明镧可以进入脑内并蓄积，导致神经系统损伤和功能异常[2]。氨基酸类神经递质包括兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸，谷氨酸 (glutamic acid, Glu)、天冬氨酸 (aspartic acid, Asp) 是2种主要兴奋性氨基酸，甘氨酸 (glycine, Gly)、牛磺酸 (taurine, Tau) 及γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 是3种重要的抑制性氨基酸，它们是中枢神经系统内的主要氨基酸类神经递质，参与调节突触信号传递，发挥调节学习、记忆等作用。本研究通过观察亚慢性氯化镧暴露后仔鼠海马组织中兴奋性和抑制性氨基酸神经递质含量变化，探讨亚慢性镧暴露对神经细胞毒性作用机制，结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器氨基酸标准品Glu、Asp、Gly、GABA、Tau (美国Sigma公司)，邻苯二甲醛 (美国Sigma公司)，醋酸钾 (分析纯，天津市光复精细化工研究所)，甲醇 (色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)；高效液相色谱仪 (美国惠普公司)，C18色谱柱 (大连依利特有限公司)，超声波细胞粉碎机 (宁波新艺超声设备有限公司)，穿梭箱 (安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)。
1.2 实验动物健康雌、雄性Wistar大鼠购自中国医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK (辽)2013-0001，使用许可证号：SYXK (辽)2013-0007，体重 (260±10) g。实验动物室温度17~23 ℃，相应湿度45%~55%。将雌雄大鼠按1:1同笼交配，发现阴栓者定为受孕，记为妊娠第0天，孕鼠单笼饲养并自由摄水。随机将雌鼠分为对照组 (饮用蒸馏水)，低、中、高剂量染镧组 (饮用含0.25%、0.50%、1.00% LaCl3的蒸馏水溶液)，每组6只。子代大鼠在断乳前经由母体血循环和吸吮母乳染镧，断乳后则通过自行饮水摄入，至断乳后1个月结束[3]。
1.3 穿梭箱实验设定穿梭箱刺激电流1.2 mA，蜂鸣时间10 s，间隙时间20 s，电击时间5 s，循环次数20次。实验开始后，穿梭箱内双侧分别发射红外光线，仔鼠若位于箱中央，当其挡住两侧任一光线时，该次穿梭即告结束；若在右侧，则必须挡住左侧光线才算完成1次穿梭，反之亦然。在峰鸣阶段完成穿梭称为主动回避，在电刺激阶段完成穿梭称为被动回避，循环20次结束。每天训练2轮，连续5 d。训练结束后间隔1周，在相同条件下再次将仔鼠放入穿梭箱内，记录电击次数、电击时间和主动逃避潜伏期[4]。
1.4 高效液相色谱荧光检测氨基酸含量海马组织称重0.1 g，加9倍预冷生理盐水匀浆5 min，冰浴下超声海马组织，3 00 r/min，4 ℃离心20 min，取上清，稀释10倍，吸取1 μL稀释液以考马斯亮蓝法测定海马蛋白质含量。另取上清, 10 000 r/min，4 ℃高速离心20 min后，稀释50倍取100 μL，加邻苯二甲醛衍生试剂200 μL，混匀静置2 min后，进样20 μL。吸取标准液或样品上清液，加入氢氧化钠溶液邻苯二甲醛衍生试剂，混匀静置后进样。色谱条件：C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm×5 μm)，柱温35 ℃。流动相A：甲醇。流动相B：0.1 mol/L醋酸钾溶液，pH=5.89，醋酸调节流动相B的pH值。A相梯度洗脱条件为0~2 min，20%~47%；2~11 min，47%~53%；11~14 min，53%~100%；14~19 min，100%~100%；20 min，20%；平衡5 min，25 min结束洗脱。荧光检测器，激发波长λex=250 nm，发射波长λem=395 nm，峰面积用外标法定量[5]。氨基酸含量以μmol/gpro表示。
1.5 统计分析实验数据用x±s表示，采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，应用单因素方差分析进行组间差异的显著性检验，采用最小显著差异t检验法进行2组间差异的显著性检验。当P < 0.05时，表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 镧对仔鼠生长发育影响 (表 1)
|
表 1 染镧对仔鼠体重及脏器系数影响 (x±s，n=8) |
与对照组比较，中、高剂量lanthanum chloride (LaC13) 组仔鼠体重降低；高剂量LaC13组仔鼠体重低于中剂量LaC13组；各组仔鼠脏器系数无明显差异。
2.2 镧对仔鼠学习记忆能力影响 (表 2)|
|
表 2 镧对仔鼠电击时间、主动逃避潜伏期影响 (s，x±s，n=8) |
与对照组比较，中、高剂量染镧组仔鼠电击时间、主动逃避潜伏期延长，差异有统计学意义 (P < 0.05)；高剂量染镧组仔鼠电击时间、主动逃避潜伏期长于中、低剂量染镧组，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
2.3 氨基酸神经递质色谱图 (图 1、2)
|
注：1：Asp；2：Glu；3：Gly；4：Tau；5：GABA。 图 1 氨基酸标准品色谱图 |
|
注：1：Asp；2：Glu；3：Gly；4：Tau；5：GABA。 图 2 仔鼠海马组织中不同氨基酸递质色谱图 |
在本实验条件下，5种氨基酸可良好分离，保留时间分别为Asp：2.7 min，Glu：4.0 min，Gly：8.5 min，Tau：9.6 min，GABA：11.1 min。
2.4 镧对仔鼠脑海马组织中氨基酸神经递质含量影响 (表 3)|
|
表 3 镧对仔鼠海马组织中不同氨基酸递质含量影响 (μmol/gpro，x±s，n=8) |
与对照组比较，中、高剂量染镧组仔鼠海马组织中兴奋性氨基酸递质Glu、Asp含量升高，抑制性氨基酸递质Gly、GABA、Tau含量也升高，差异有统计学意义 (P < 0.05)；呈剂量效应关系。
3 讨论流行病学调查发现婴幼儿发中稀土元素含量明显高于母亲，可能与孕妇摄入的稀土元素能够通过胎盘屏障进入胎儿体内，使胎儿暴露于宫内高稀土环境中有关；胎儿出生后，可通过包括乳汁在内的各种途径继续吸收稀土元素，而且婴幼儿消化道对稀土元素的吸收率高而络和促排效果较成人差，因此，婴幼儿暴露于稀土的机会可能高于成人，会伴发更大危害[6]。研究显示，镧也可通过胎盘和哺乳进入仔鼠体内[7]，可能与幼年动物肠壁发育不健全导致镧吸收量较多有关；氯化镧染毒大鼠，大脑皮质、小脑和海马中出现较高的镧蓄积，同时大鼠学习记忆能力损伤[8]。本研究结果显示，中、高剂量染镧组仔鼠电击时间、主动逃避潜伏期明显长于对照组，且呈剂量效应关系。提示，染镧可致仔鼠学习记忆能力下降。
Glu和Asp是中枢神经系统内最主要的兴奋性神经递质，对突触前、后神经元起到兴奋调节作用，其释放增加可导致神经兴奋性毒性作用[9]。而Gly、GABA和Tau对突触传递主要起抑制作用，以防止神经元的过度兴奋[10]。Gly和GABA均是突触后抑制递质，GABA是突触前抑制递质，介导抑制性突触的信息传递，Gly通过激活GABA受体而发挥其生物学效应，使细胞处于超级化状态，防止细胞异常兴奋[11]。Tau是组织细胞内含量丰富的一种自由氨基酸，在中枢神经系统中的作用类似于GABA，同样发挥神经兴奋的抑制功能。Tau具有促进神经系统生长发育和增殖分化、增强大鼠学习记忆等作用[12]。有研究显示，Tau可对抗Glu的神经兴奋作用，减轻神经细胞过度兴奋后导致的细胞凋亡反应[13]。海马内兴奋性氨基酸神经递质与抑制性氨基酸神经递质的平衡状态，有助于维护神经细胞正常功能。如果二类氨基酸神经递质释放异常，可能严重干扰突触信息的正常传递。当兴奋性氨基酸递质大量释放时，抑制性氨基酸递质的释放也随之增加，但当兴奋性神经递质含量增加幅度过大时，抑制性氨基酸递质难以抵消其作用，即造成神经元的调控功能发生障碍，进而引起神经细胞凋亡、学习记忆能力下降。
本研究结果显示，中剂量染镧组仔鼠海马Glu、Asp、Gly、GABA、Tau含量高于对照组，仔鼠回避反射学习记忆能力也低于对照组；高剂量染镧组仔鼠海马Glu、Asp、Gly、GABA、Tau含量均进一步升高，仔鼠回避反射学习记忆能力则进一步下降，呈明显剂量效应关系。由此推测，镧可能通过神经递质代谢异常机制造成神经细胞损伤，引发神经细胞凋亡，从而造成学习记忆能力下降。
| [1] | 范广勤, 袁兆康, 郑辉, 等. 儿童稀土暴露的健康研究[J]. 卫生研究, 2004, 33(1): 23–28. |
| [2] | Feng L, Xiao H, He X, et al. Neurotoxicological consequence of long-term exposure to lanthanum[J]. Toxicol Lett, 2006, 165: 112–120. DOI:10.1016/j.toxlet.2006.02.003 |
| [3] | 郑琳琳, 蔡原, 于飞, 等. 亚慢性镧暴露对仔鼠海马核转录因子-κB表达的影响[J]. 中国公共卫生, 2015, 31(1): 92–94. DOI:10.11847/zgggws2015-31-01-28 |
| [4] | 郑琳琳. 镧对大鼠回避学习能力的影响[J]. 辽东学院学报, 2015, 22(1): 54–56. |
| [5] | 桂莉, 田洪, 郑健, 等. 高效液相色谱荧光法同时测定小鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质[J]. 第三军医大学学报, 2009, 8(8): 675–678. |
| [6] | 彭瑞玲, 潘小川, 解清. 稀土矿区婴幼儿与其母亲头发中稀土含量的研究[J]. 中华预防医学杂志, 2003, 37(1): 20–22. |
| [7] | Yang J, Liu Q, Zhang L, et al. Lanthanum chloride impairs memory, decreases pCaMK Ⅳ, pMAPK and pCREB expression of hippocampus in rats[J]. Toxicol Lett, 2009, 190(2): 208–214. DOI:10.1016/j.toxlet.2009.07.016 |
| [8] | Zheng L, Yang J, Liu Q, et al. Lanthanum chloride impairs spatial learning and memory, downregulates NF-κB signalling pathway in rats[J]. Archives of Toxiclogy, 2013, 87(12): 2105–2117. DOI:10.1007/s00204-013-1076-7 |
| [9] | Krüger K, Repges H, Hippler J, et al. Effects of dimethylarsinic and dimethylarsinous acid on evoked synaptic potentials in hippocampal slices of young and adult rats[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2007, 225: 40–46. DOI:10.1016/j.taap.2007.07.007 |
| [10] | Scolari MJ, Acosta GB. D-serine:a new word in the glutamatergic neuro-glial language[J]. Amino Acids, 2007, 33: 363–374. |
| [11] | Treiman DM. GABA ergic mechanisms in epilepsy[J]. Epilepsia, 2001, 42: 8. DOI:10.1046/j.1528-1157.2001.042suppl.3008.x |
| [12] | 梁尚栋, 李焕英. 牛磺酸在神经系统中的生理作用和病理作用[J]. 国外医学:生理、病理学与临床分册, 2002, 22(1): 76–77. |
| [13] | Idrissi AE, Trenkner E. Growth factors and taurine protect against excitotoxicity by stabilizing calcium homeostasis and energy metabolism[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 1999, 19(21): 9459–9468. |