2017, Vol. 33
烟草的使用是重要的公共健康问题[1]。吸烟者每天吸入的烟草剂量与某些吸烟有关疾病发生风险有相关性[2]。烟草中的生物碱是主要活性成分。在已发现的20多种生物碱中，尼古丁含量最高，占总生物碱的98%。尼古丁易使人上瘾并产生依赖性，长期吸入会损害人体健康[3-4]。在人体内，尼古丁可经细胞色素氧化酶 (cytochrome P450 2A6, CYP2A6) 代谢转化为可替宁[5]。研究发现，人体唾液、血液及尿液中均能检测到尼古丁和可替宁[6-7]。因此，尼古丁和可替宁被广泛用于评估暴露者的烟草暴露剂量和程度的生物标志物。本研究基于改进的QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) 预处理技术，于2015年11月22日-12月12日采集重庆医科大学6例吸烟者和10例不吸烟者尿液样本，建立一种适于同时检测尿液中尼古丁和可替宁的气相色谱法。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂GC 9720气相色谱仪附氢火焰离子化检测器 (浙江福立公司)；Fresco 17冷冻离心机 (德国Thermo Fisher公司)；Millipore超纯水过滤装置 (美国Millipore公司)；VORTEX-QILINBEIER 5旋涡振荡器 (美国Scientific Instrument公司)；FA1004A电子天平 (上海精天公司)；针头过滤器 (0.22 μm，天津津腾公司)。尼古丁 (纯度≥98%)、可替宁 (纯度≥98%) 和内标喹啉 (纯度≥99%) 标准品 (美国Sigma-Aldrich公司)；一级二级胺 (primary secondary amine，PSA，60 μm)、石墨化炭黑 (graphitized carbon black，GCB，60 μm)、十八烷基硅烷 (octadecysilane, end-capped，C18EC，60 μm) 和无水硫酸镁 (纯度> 98.5%)(美国Agilent公司)；色谱级的甲醇、乙腈和氨水 (美国Fisher公司)；实验用水经MilliQTM系统纯化。
1.2 受试者尿液采集2015年11月22日-12月12日，简单随机抽样方法收集重庆医科大学6例吸烟者标本，年龄17~23岁，烟龄1~3年，均为男性，采集尿样用于实际样本分析。同时收集重庆医科大学10份不吸烟者尿样作为空白样，混匀分装。10份空白样标本与吸烟组标本年龄、性别匹配，并排除被动吸烟情况。
1.3 方法 1.3.1 标准溶液配制分别称取一定量的尼古丁、可替宁和喹啉标准品，用甲醇配制成1 mg/mL标准储备液，于-20 ℃冰箱保存备用。临用时，取尼古丁和可替宁标准溶液，加入一定量的喹啉标准液作为内标，用甲醇稀释成不同浓度的混合标准工作液。
1.3.2 样本采集和预处理采集受试者尿液分装于50 mL离心管中，置于-20 ℃下保存。样本预处理:(1) 提取取尿样5 mL，加入50 μL 20 μg/mL内标溶液，涡旋混匀1 min后，用氨水调节pH至8。加入4 mL乙腈和5 g无水硫酸镁后，立即剧烈振摇1 min以防止无水硫酸镁凝聚成块，8 000 g离心10 min。(2) 净化另取1支1.5 mL离心管，分别加入25 mg PSA，25 mg GCB和100 mg无水硫酸镁。将1 mL离心后的上清液转移至此离心管中，立即剧烈振摇1 min，10 000 g离心20 min。上清液经0.22 μm过滤器过滤后，取1 μL进样分析。
1.3.3 气相色谱样本分析色谱分离选用DB-5 ms毛细管气相色谱柱 (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度290 ℃；接口温度280 ℃；检测器温度290 ℃；N2流量30 ml/min，分流比40；H2流量30 ml/min；O2流量300 ml/min；柱温：初始温度50 ℃，保持时间1 min，以升温速率15 ℃/min升温至200 ℃，保持时间1 min；再以升温速率20 ℃/min升至最终温度300 ℃；进样量1 μL。
1.4 统计分析采用Origin 7.0进行线性拟合，以待测物峰面积与内标峰面积之比减去空白样中待测物峰面积与内标峰面积之比y对待测物浓度x进行回归分析，计算线性回归方程。根据实际样本的峰面积比值，由回归方程计算样本中尼古丁和可替宁的含量。采用Origin 7.0进行待测物的代谢动力学浓度-时间曲线拟合。采用Excel 2003进行样本浓度的变异系数 (coefficient of variation, CV) 和相对误差 (relative error, RE) 计算。CV=(标准偏差/平均值)× 100%；RE=(绝对误差/真实值)× 100%。
2 结果 2.1 样本预处理条件的确定 2.1.1 提取剂的确定 (图 1)
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图 1 乙腈加入的体积对待测物提取效率的影响 (n=3) |
尼古丁分子中有2个氮原子 (pKa值分别为6.16和10.96)，在酸性介质中不稳定，易形成双盐形式，降低提取效率。结果显示，当用氨水调节尿液基质至pH 8时，2种待测物的提取效率最高。选择等量的甲醇、乙腈和苯作为提取剂，考察其对尼古丁和可替宁的提取效率。与甲醇和苯相比，经乙腈处理的样本，杂质峰明显减少，且尼古丁和可替宁的峰面积较大、重现性较好。因此，本研究选择乙腈作为提取剂。接着，比较了3、3.5、4、4.5、5 mL 5个乙腈不同加入体积对提取效率的影响。结果显示，经4 mL乙腈提取后的待测物峰面积最大，且重现性相对较好[相对标准偏差relative standard deviation (RSD) < 10%]。因此，本研究最终选择4 mL乙腈作为提取剂。
2.1.2 吸附剂的确定 (图 2)
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图 2 不同吸附剂组合对待测物净化效率的影响 (n=3) |
QuEChERS方法测定食品中农残常用的吸附剂有PSA、C18EC和GCB 3种。PSA作为一种弱阴离子交换剂，主要用于除去基质中的有机酸、糖和色素等极性物质。C18EC和GCB是2种非极性吸附剂，适于在极性样品中吸附非极性和中极性的化合物。尤其，GCB有利于除去疏水相互作用的化合物，例如类胡萝卜素和叶绿素。本研究考察7种不同组合的吸附剂 (PSA、C18EC、GCB、PSA+C18EC、PSA+GCB、C18EC+GCB、PSA+C18EC+GCB) 对尿液中尼古丁和可替宁净化效率的影响。结果显示，采用PSA+GCB吸附剂组合测得的样本中2种分析物的峰面积最大，其净化效果最优。因此，选择PSA+GCB作为二元吸附剂用于尿液样本的净化。
2.2 色谱条件的选择 2.2.1 色谱柱的选择选择合适的色谱柱可以很大程度地改善待测物的分离和保留行为。本研究比较了美国Agilent公司的DB-5 ms (30 m×0.25 mm，0.25 μm)、DB-35 ms Ultra Inert (15 m×0.25 mm，0.25 μm) 和DB-1 ms (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)3种毛细管色谱柱对分析物分离效果的影响。实验得出，相比中等极性填料的DB-35 ms色谱柱，采用非极性填料的DB-5 ms和DB-1 ms柱，2种待测物的分离效果更好。尤其，采用DB-5 ms色谱柱，待测物的对称性最佳。因此，最终选择DB-5 ms色谱柱进行色谱分离。
2.2.2 升温模式的选择 (图 3)
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注：(a) 非吸烟者尿液加标；(b) 吸烟者尿样。 图 3 尿液中尼古丁和可替宁的典型色谱图 |
本研究比较了等温和程序升温2种不同的模式。等温模式下，虽基线较平稳，但待测物的色谱峰出现展宽，且整个检测时间较长 (20 min)。而采用程序升温后，不仅大大缩短了色谱分析的时间 (8.5 min)，而且待测物的分离度明显提高，峰形得到较大改善，程序升温的具体条件见1.3.3。基于已优化的样本预处理条件和色谱条件，检测获取的加标样本和实际样本的色谱图分别呈现于图 3(a)和图 3(b)。由图可得，尼古丁和可替宁的保留时间分别为5.9 mim和8.0 min，整个色谱分析时间为8.5 min。
2.3 最低检出限 (limit of detection，LOD) 和最低定量限 (limit of quantification, LOQ)(图 4)
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注：实线：尼古丁；虚线：可替宁。 图 4 尼古丁和可替宁的标准曲线 |
配制含有内标的系列标准溶液0、0.5、1、5、10、20、100、250、500 μg/mL，各取50 μL加入混合尿液中，按1.3.2节中“样本预处理”项操作，校准样品每个浓度平行测定3份。以尿液中加入待测物的浓度为横坐标，尿液中待测物峰面积与内标峰面积的比值减去空白尿液中待测物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，尼古丁的线性范围为0.5~500 μg/mL，相关系数 (r) 为0.999 8；可替宁的线性范围为5~500 μg/mL，r=0.998 9。LOD和LOQ分别为产生性噪比 (S/N) 等于3和10时的最低浓度。尼古丁的LOD和LOQ分别为0.09 μg/mL和0.30 μg/mL；可替宁的LOD和LOQ分别为和0.75 μg/mL和2.50 μg/mL。
2.4 准确度和精密度 (表 1)
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表 1 尿液中尼古丁和可替宁的准确度 (RE) 和精密度 (CV)(x±s，n=5，μg/mL)) |
分别取含低、中、高浓度待测物的尿液样本进行准确度和精密度测定，按1.3.2节中“样本预处理”项操作。日内每个浓度水平重复测定5次，连续测定5 d。准确度由浓度的相对误差 (RE) 表示；精密度由浓度的变异系数 (CV) 表示。测定结果见表 1。2种待测物日内的RE和CV在10.0%以内，日间RE和CV在10.4%以内。
2.5 平均回收率 (表 2)|
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表 2 尿液中尼古丁和可替宁的平均回收率 (n=5，μg/mL)) |
在非吸烟人混合尿液中加入50 μL低、中、高3个浓度水平的混合标准液，按1.3.2节中“样本预处理”项操作，进行回收率测定。尼古丁的平均回收率在93.2%~107.8%范围内；可替宁的平均回收率在94.6%~99.2%范围内。
2.6 稳定性将1 mg/mL尼古丁和可替宁标准品的混合储备液放置在4 ℃冰箱冷藏，分别测定其放置0、1、2、3、4周后尼古丁和可替宁的含量，通过计算不同保存时间的降解率来判断标准品的稳定性。结果显示，尼古丁和可替宁标准品在4周内浓度无明显变化，其降解率 < 5%。因此，标准品的混合储备液在4 ℃条件下可保存1个月。将吸烟者的混合尿样按1.3.2节中“样本预处理”项操作后，分别测定其在室温下放置0、1、10、24 h后尼古丁和可替宁的含量，通过计算不同保存时间的降解率来判断样本处理液中待测物的稳定性。结果显示，样品处理液中待测物在24 h内浓度无明显变化，降解率 < 3%。因此，样品处理液在室温下可保存1 d。
2.7 实际样本分析 (图 5)
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图 5 受试者吸入尼古丁后尿液中尼古丁和可替宁的代谢动力学每个点以x±s表示 (n=6) |
采用本方法分别测定6名烟龄为1~3年的年轻男性 (平均年龄22岁) 吸入约0.6 g尼古丁后，随不同时间点尼古丁和可替宁的浓度变化。采集其1、2、3、4、6、8、12、16、24 h后的尿液，按1.3.2节中“样本预处理”项操作，测定各时间点尼古丁和可替宁的浓度。尿液中尼古丁和可替宁的代谢变化趋势见图 5。如图，尽管尼古丁在体内经细胞色素氧化酶CYP2A6代谢转化为可替宁，但仍有部分以原型形式从尿液中排出。当吸烟1 h后，尼古丁在尿液中的平均浓度达到最大值 (115.9 μg/mL)，经16 h后能基本代谢完全。可替宁在吸烟2 h后平均浓度出现了最大值 (160.2 μg/mL)，尿液中的可替宁经16 h后也基本能排泄完全。
3 讨论据近年国际国内的研究调查表明，吸烟已成为危害人类健康的第一杀手[8]。目前，检测生物体液中尼古丁和可替宁的方法主要有气相色谱法[9-10]、气质联用法[11-13]、液质联用法[14-20]等。与质谱仪器昂贵，对操作人员要求高，检测成本高相比，气相色谱更易成为检测生物体液中烟草含量的常规方法。采用气相色谱分析样本时，样本基质对目标化合物的保留和分离有很大的干扰，从而影响定量分析。以往的研究中，生物体液样本预处理主要采用消解法[9-10]，蛋白沉淀法[9, 21]和固相萃取法[19, 22]。消解法操作繁琐，操作时间较长。蛋白沉淀法操作虽简单，但净化效果较差，基质干扰较大。固相萃取法净化效果和重现性虽较好，但过程相对繁琐 (包括柱活化、上样、淋洗、洗脱)，操作时间和溶剂用量消耗均较大。QuEChERS方法是近年来由Anastassiades等[23]发展起的一种新的样本预处理技术，该方法主要包括提取和净化2个步骤。QuEChERS方法操作简单、快速、成本低，且净化效果好，目前已在食品基质农残检测领域获得广泛应用。但QuEChERS方法在生物体液 (如尿液) 基质预处理的应用上目前还很少。
本研究通过对QuEChERS预处理方法中提取剂和净化剂的优化，探索出适用于尿液中尼古丁和可替宁浓度的同时检测分析方法。所选择的萃取剂 (乙腈) 与之前固相萃取方法相比[19, 22]，大大降低了有机试剂的用量，更环保、更安全。采用正交试验探究出最适宜的吸附条件，较已有预处理方法，大大降低了基质的干扰，更利于气相色谱的分析测定；通过升温模式和色谱条件的优化，较之前文献报道的方法[9-20]缩短了分析时间，使检测更快速；且该方法的准确度、精密度和回收率均能满足检测的需要。将该方法用于暴露者的烟草暴露剂量评估和代谢动力学研究，发现结果与Kataoka等[24]的研究结果基本一致。由此说明，较现有文献报道的方法，本方法在满足同时对尿液中尼古丁与可替宁浓度检测分析的测定条件下，在操作、试剂用量、减少有机试剂污染、降低检测成本等方面上，均具优势。
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